[發明專利]腸道病毒口服基因疫苗及其制備和應用

無效

• 申請號: 201110221964.5
• 申請日: 2011-08-04
• 公開（公告）號: CN102727908A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 貌盼勇;劉澤;胡燕;白冰珂;高蓉;沈宏輝;侯俊;王志杰;羅聲棟;柴艷濤
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三〇二醫院;北京綠竹生物制藥有限公司
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/125;A61P31/14
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司 11100
• 代理人: 劉徐紅

技術領域

本發明涉及一種腸道病毒口服基因疫苗及其制備和應用，具體為利用減毒傷寒沙門菌遞送的一種腸道病毒71型VP1基因疫苗和一種柯薩奇病毒A16型VP1基因疫苗及其制備和應用，屬于腸道病毒口服基因疫苗的設計制造及免疫效果檢測的生物學領域。

背景技術

手足口病嚴重危害人類尤其是兒童的健康和生命安全，其主要病原是腸道病毒71型(enterovirus?71，EV71)和柯薩奇病毒A16型(CoxsackievirusA16，CA16)，目前尚無特效的預防和治療手段。DNA疫苗較傳統的減毒活病毒疫苗或者滅活病毒疫苗，省去了病毒篩選、培養、純化等步驟，僅需獲得抗原序列即可批量生產，大大縮短了疫苗生產周期并降低了成本。采用口服減毒傷寒沙門菌遞送DNA疫苗的方式，接種方便無痛苦，還省去了疫苗純化的過程，進一步降低了疫苗生產成本和縮短了疫苗生產周期。

選擇合適的目的基因和載體體外連接構建重組質粒，是研究DNA疫苗的關鍵基礎步驟。對所選目的基因的要求是：能夠誘導機體產生較強的針對病原抗原的特異性細胞免疫反應。EV71和CA16的基因組只含一個大的開放讀碼框架(ORF)，編碼一個較長的多聚蛋白前體。前體蛋白由病毒編碼的蛋白酶切割產生成熟蛋白。該ORF依次分為P1、P2和P3三個區，其中P1區編碼病毒的結構蛋白VP1到VP4，組成病毒衣殼，其中和抗原決定簇主要位于衣殼蛋白VP1上。因此以VP1基因為目的基因構建DNA疫苗可獲得較強的免疫反應。

減毒傷寒沙門菌是一種細胞內生活菌，通過口服或者鼻黏膜接種后，刺激局部黏膜免疫的同時，大部分減毒傷寒沙門菌還可以穿透過黏膜上皮進入肝、脾等器官并長期生存，直接將DNA疫苗遞送于抗原呈提細胞，提高疫苗利用率并長期穩定地誘導系統免疫。重組減毒傷寒沙門菌作為疫苗遞送載體，具有制備簡便、無需佐劑、接種方便、生物利用率高、免疫原性強且持續時間長等優點。

本發明針對利用減毒傷寒沙門菌遞送DNA疫苗的諸多特性和優點，采用現代分子生物學技術和手段對其進行了進一步的研究和改進。

發明內容

本發明的第一個目的在于提供一種腸道病毒VP1基因疫苗，以腸道病毒VP1基因為目的基因構建的腸道病毒口服基因疫苗，如以腸道病毒71型(V-EV?VP1)和柯薩奇病毒A16型(V-CA?VP1)VP1基因為目的基因構建的重組腸道病毒口服基因疫苗。

本發明的第二個目的在于公開一種攜帶腸道病毒71型VP1基因的重組減毒傷寒沙門菌(SL/V-EV?VP1)和一種攜帶柯薩奇病毒A16型VP1基因的重組減毒傷寒沙門菌(SL/V-CA?VP1)。

本發明的第三個目的在于提供一種攜帶腸道病毒71型VP1基因的重組減毒傷寒沙門菌和一種攜帶柯薩奇病毒A16型VP1基因的重組減毒傷寒沙門菌用于手足口等疾病的預防和治療。

為了實現本發明的目的，采用以下技術方案：

一種腸道病毒VP1基因疫苗，其特征在于：其包括真核細胞表達載體VR1012上插入核苷酸序列的腸道病毒VP1基因。

一種優選的技術方案，其特征在于：所述的腸道病毒VP1基因是腸道病毒71型VP1基因(V-EV?VP1)。即一種腸道病毒71型VP1基因疫苗，其包括真核細胞表達載體VR1012上插入核苷酸序列的腸道病毒71型VP1基因。腸道病毒71型VP1基因的核苷酸序列，如序列表中序列1所示，該目的基因的真核細胞表達載體為VR1012。

一種構建腸道病毒71型VP1基因疫苗(V-EV?VP1)的方法，其步驟如下：首先以含有腸道病毒71型VP1基因的質粒pT-EV71-3為模板，用PCR擴增出腸道病毒71型VP1基因序列，連入T-Easy載體，再通過雙酶切及再連接將目的基因連入真核表達載體VR1012，克隆篩選得到腸道病毒71型VP1基因疫苗質粒。

一種優選的技術方案，其特征在于：所述的腸道病毒VP1基因是柯薩奇病毒A16型VP1基因(V-CA?VP1)。即一種柯薩奇病毒A16型VP1基因疫苗，其包括真核細胞表達載體VR1012上插入核苷酸序列的柯薩奇病毒A16型VP1基因。柯薩奇病毒A16型VP1基因的核苷酸序列，如序列表中序列3所示，該目的基因的真核細胞表達載體為VR1012。