[發明專利]魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因及其應用無效

申請號：	201110221829.0	申請日：	2011-08-04
公開（公告）號：	CN102559711A	公開（公告）日：	2012-07-11
發明（設計）人：	陳雯莉;汪方奎;支遙;王莉;張巨源	申請（專利權）人：	華中農業大學
主分類號：	C12N15/53	分類號：	C12N15/53;C12N9/04;C12N15/10;A01H5/00
代理公司：	武漢開元知識產權代理有限公司 42104	代理人：	王和平
地址：	430070 湖***	國省代碼：	湖北;42
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摘要：
搜索關鍵詞：	魚腥藍細菌酮基脫氫酶基因及其應用
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及魚腥藍細菌基因工程技術領域，具體涉及魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因，本發明還涉及該基因的克隆方法及其在抗百草枯除草劑轉基因植物中的應用。

背景技術

雜草控制是農業生產管理中的重要環節。傳統的雜草控制主要通過不斷耕耘及人工除草進行。上個世紀四十年代，隨著對雜草的化學控制技術的深入發展，一系列用于雜草控制的化學除草劑開始大量出現。目前應用最廣泛的除草劑包括苯氧羧酸類的二四滴及其衍生物；苯甲酸類如百草敵等；有機磷類如草甘膦及其衍生物；聯吡啶類如百草枯等。

抗除草劑轉基因作物通過增加作物對特定除草劑的耐受能力，能夠一次性高效殺滅雜草，進行無耕種植，減少水土流失；尤其在草坪工業、育種育苗領域有著傳統除草劑難以比擬的優勢。同時抗除草劑作物也能極大減輕除草劑本身對于作物的影響，增加農業產量。世界上第一個抗除草劑轉基因作物是1996年美國出現的抗草甘膦轉基因大豆，此后抗除草劑轉基因油菜、棉花、玉米、甜菜、苜蓿等陸續推出商用種植?？钩輨┺D基因作物的物質基礎是抗除草劑的基因資源的分離和運用。以抗草甘膦為例，目前已經運用的主要有超表達EPSPs(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)或超表達草甘膦氧化酶和草甘膦N-乙酰轉移酶來解除草甘膦對作物的毒性等。目前商品化最為廣泛的是美國孟山都公司所擁有的Roundup?Ready作物。目前全球已經有超過50個抗除草劑轉基因作物進行了商業種植，主要的除草劑與抗性基因搭配為草甘膦---CP4epsps，草丁膦-pat或者bar，辛酰鹵苯腈---bxn，磺酰脲類-surB。

“百草枯”又名“克無蹤”，是世界上用量第二大的除草劑，僅次于草甘膦。它具有非選擇性和觸殺特性，因此被廣泛用于農業和園藝除草以及棉花、大豆等的催枯。百草枯的作用機理是通過干擾光合植物的光合反應中心I(PSI)附件的電子傳遞，并介導生成活性氧(Reactive?oxygen?species)組分，對細胞產生致死效應。目前認為細胞主要通過增加對百草枯的外排能力或者降低其吸收能力來降低細胞內的百草枯濃度，從而提升對環境百草枯的抗性。目前尚無抗百草枯轉基因作物的報道。涉及百草枯抗性的相關基因主要是一些編碼ABC型轉運子的基因如大腸桿菌的emrB、emrE等(Prosecka，Orlov?et?al.2009)。

發明內容

本發明的目的在于提供一種來自魚腥藍細菌的2-酮基-肌醇脫氫酶基因，以及該基因的克隆方法及其在抗百草枯除草劑轉基因植物中的應用。

本發明的上述目的是通過以下技術方案實現的：

一種魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因，該基因是由1116個核苷酸組成，它的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

上述魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因所編碼的多肽，由371個氨基酸組成，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。多肽的分子量大小約為41.22千道爾頓(kDa)。

上述魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因的克隆方法包括以下步驟：

(1)分離魚腥藍細菌總DNA；

(2)根據魚腥藍細菌的基因組序列，設計上下游引物：上游引物為GCCCATATGTTGGCAAAAAATGAG；下游引物為GCCCTCGAGGGAAATAGGTTATAAGTC，在上下游引物中分別引入NdeI和XhoI核酸內切酶酶切位點；

(3)以魚腥藍細菌總DNA為模板，利用上下游引物進行PCR擴增，得到PCR產物；

(4)回收PCR產物；

(5)將PCR產物利用NdeI和XhoI核酸內切酶連入克隆載體pBSpetE中，構建重組質粒；

(6)用重組質粒轉化大腸桿菌，進行培養、活化。