[發明專利]檢測腸道病毒中和抗體的方法及其專用重組病毒

無效

• 申請號: 201110220476.2
• 申請日: 2011-08-02
• 公開（公告）號: CN102911948A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 李文輝;宋子林;陳盼;祁永和;梁爭論;吳星;沈心亮
• 申請（專利權）人: 北京生命科學研究所
• 主分類號: C12N15/41
• 分類號: C12N15/41;C12N15/53;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N7/01;C07K14/085;C12Q1/70;C12Q1/66;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及檢測腸道病毒中和抗體的方法及其專用重組病毒。

背景技術

腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)及柯薩奇病毒A16(coxsackievirus?A16，CA16)是小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)成員，它們是在兒童中引發手足口病(hand?and?foot?and?mouth?disease，HFMD)主要的兩種病原。我國在20世紀80～90年代流行的HFMD病原體以CA16為主，但是自2008年以來，中國內地很多地區出現手足病的局部暴發，基本上是EV71和CA16的共循環所致(曲梅，李潔，賈蕾，檀曉娟，高志勇，嚴寒秋，郭婧，李錫太，黎新宇，王全意，許文波，黃芳；北京市2009年手足口病的病原構成及柯薩奇A組16型病毒基因特征分析；病毒學報；第26卷第6期；432-436頁)。手足口病的免疫保護以特異性中和抗體為主，血清中和抗體水平是判斷人群及個體對EV71敏感性的重要指標；手足口病中和抗體的檢測也是疾病確診的重要依據。另一方面，因為手足口病主要危害低齡兒童，病死率又高，針對EV71和CA16的疫苗的研制十分緊迫。而疫苗能否在體內誘導出高滴度的中和抗體是疫苗評估和質量控制的重要依據。因此開發出適合于快速，大規模地檢測EV71和CA16病毒的中和抗體滴度的方法十分重要。

目前比較常用的檢測中和抗體效價的方法有三大類：病毒中和試驗，酶標記檢測方法，抗原-抗體間接凝集抑制試驗。(English?reference：Stanley，Plotkin，Walter?Orenstein，Paul?Offit；Vaccines，Fifth?edition；poliovirus?vaccine(inactivated，IPV)Page?618-19；查錦芬，肖長義，佐滿珍；疫苗中和抗體體外檢測方法的研究進展；中國醫藥生物技術2008年10月第3卷第5期；374-377頁)。

病毒的中和試驗是一種以比較病毒受血清中和后殘存的感染力為依據，進而判定免疫血清中和病毒能力的方法。早期的病毒中和試驗用動物接種，檢測病毒感染后血清中殘留病毒的感染力，現在已全部被細胞水平的中和試驗代替。此類方法均以判定殘留的病毒感染力作為標準，主要包括以下幾種方法：1.細胞病變中和試驗。通過觀察中和抗體中和病毒后的細胞病變程度來判定血清中和抗體的水平。但是觀察到細胞病變需要時間較長，且受觀察者主觀因素的影響較大，并且很難根據細胞病變的程度對于中和抗體的活性給出一個定量的評估。2.斑點減少中和試驗。正常細胞代謝時會攝入活性染料，但是在病毒感染導致細胞死亡時，細胞會喪失該能力，從而形成無色的噬斑。所以，如果病毒被中和的話，病毒感染導致的噬斑就會減少。與細胞病變一樣，產生噬斑的時間也較長，因而根據其數量的變化從而判斷殘存的感染力同樣也需要較長時間，而且受觀察者主觀因素的影響較大。3.快速熒光灶抑制試驗(rapid?fluorescent?focus?inhibition?test，RFFIT)。將一定量的病毒與系列稀釋的待測血清在體外中和后，加入敏感細胞孵育，最后用熒光標記的針對病毒衣殼蛋白的抗體染色，以檢測未被抗體中和的殘余病毒量(熒光灶)，最后與病毒對照組相比較，可以算出各種待測血清降低病毒的熒光灶50％的稀釋度。最后與已知中和抗體滴度的參照血清比較，最終算出每種待測血清的中和抗體滴度(Sirkka?Vene，Mats?Haglund，Ake?Lundkvist，Lars?Lindquist，Marianne?Forsgren；Study?of?the?serological?response?after?vaccination?against?tick-borne?encephalitis?in?Sweden；Vaccine?25(2007)366-372)。病毒中和試驗是WHO規定的目前檢測中和抗體的參考方法，但該試驗不僅耗時，而且由于試驗中多使用活病毒，所以還需要相應的生物安全設備。試驗對技術人員操作的要求高，成本也較昂貴，不適合大規模的篩選試驗。此外，活病毒的傳代易造成病原漂變，不利于試驗的均一性。