[發(fā)明專利]一種修飾的β-分泌酶及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110219988.7
• 申請日: 2011-08-02
• 公開（公告）號: CN102321600A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 慶宏;冉媛媛;王茸;英鄭新;趙娟;鄧玉林;張彥彥;王冉
• 申請（專利權(quán)）人: 北京理工大學(xué)
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C12N15/57;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12Q1/02;G01N33/573;A61K49/00
• 代理公司: 北京理工大學(xué)專利中心 11120
• 代理人: 楊志兵;張利萍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種修飾的β-分泌酶(β-secretase，又稱β-site?amyloid?cleavage?enzyme，BACE)及其應(yīng)用，具體地說，涉及到利用分子生物學(xué)技術(shù)得到β-分泌酶1(BACE1)中與泛素蛋白酶特異性結(jié)合的兩個賴氨酸位點，并對所述賴氨酸位點進(jìn)行修飾得到修飾的BACE1氨基酸序列，以及所述氨基酸序列相應(yīng)的基因序列，還涉及所述修飾的BACE1的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s?disease，AD)又稱為老年性癡呆癥，是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶損害為特征的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要發(fā)生于老年前期和老年期，目前全世界有3500多萬名患者。AD的病理特征之一是β-淀粉樣蛋白(Aβ)聚積在大腦皮層中細(xì)胞外形成老年斑，Aβ是由β-淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)過BACE和γ-分泌酶的兩步水解而成。然而，在正常的大腦中Aβ形成極少，在正常生理條件下大部分APP首先在Aβ結(jié)構(gòu)域內(nèi)被α-分泌酶切割，而不被BACE切割，最終沒有Aβ產(chǎn)生。在某些病理條件下(如APP基因發(fā)生突變等)，APP易被BACE作用，于APP氨基端596～597位肽鍵裂解，產(chǎn)生一個N端大片段(sAPPβ)和一個包含有Aβ完整序列的跨膜片段C99；C99再在γ-分泌酶的作用下裂解產(chǎn)生完整的Aβ分子和APP胞內(nèi)片段。Aβ在大腦中的纖維化進(jìn)程和蓄積是AD病理的始發(fā)因素，APP在BACE酶切位點被水解是產(chǎn)生Aβ的必需前提，因此，BACE在Aβ形成乃至整個AD發(fā)病機(jī)理中起關(guān)鍵作用，人們一直研究如何使用分泌酶抑制劑特異性的阻止Aβ形成，作為治療AD的方法和藥物，但是到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)可作為篩選分泌酶抑制劑的有效靶點。

BACE具有BACE1和BACE2兩個同源體。BACE1是一個具有501個氨基酸殘基并與天冬氨酸蛋白酶相關(guān)的I型膜蛋白，它主要水解切割A(yù)PP的β位點產(chǎn)生C99片段，進(jìn)而產(chǎn)生Aβ，是水解APP生成Aβ產(chǎn)物的關(guān)鍵酶。

BACE1廣泛存在于人體內(nèi)各種組織細(xì)胞的高爾基體和內(nèi)含體中，但在神經(jīng)細(xì)胞中活性最強。BACE1最初是作為未成熟的蛋白前體(分子量約為60KD)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，然后經(jīng)過一系列加工和修飾快速成熟，成熟的BACE1非常穩(wěn)定，在培養(yǎng)細(xì)胞中的半衰期是9h。BACE1基因的表達(dá)具有組織特異性，在海馬、大腦皮層、小腦顆粒神經(jīng)元和胰島中表達(dá)量最高。BACE1是淀粉樣蛋白級聯(lián)反應(yīng)中的限速酶，也是產(chǎn)生Aβ過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)對象和治療AD的潛在靶點。

BACE1的降解通過兩條途徑進(jìn)行：泛素-泛素蛋白酶體途徑(Ubiquitin-Proteasomepathway)和溶酶體(lysosomal)途徑。其中BACE1的泛素-泛素蛋白酶體途徑與AD發(fā)病機(jī)制和大腦的正常老化有關(guān)。已有研究證明BACE1的降解和APP的加工處理是由泛素-泛素蛋白酶體途徑調(diào)控。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中尚未發(fā)現(xiàn)可作為篩選分泌酶抑制劑的有效靶點的缺陷，本發(fā)明的目的之一是提供BACE1與泛素蛋白酶特異性結(jié)合的兩個關(guān)鍵賴氨酸位點并提供修飾的BACE1，所述修飾為對所述賴氨酸位點進(jìn)行缺失、取代或添加。

本發(fā)明的目的之二是提供一種編碼所述修飾的BACE1的基因。

本發(fā)明的目的之三是提供一種包含編碼所述修飾的BACE1基因的載體。

本發(fā)明的目的之四是提供一種包含所述載體的宿主細(xì)胞，所述載體為包含編碼所述修飾的BACE1基因的載體。

本發(fā)明的目的之五是提供一種篩選所述賴氨酸位點及制備所述修飾的BACE1的方法。

本發(fā)明的目的之六是提供所述修飾的BACE1的應(yīng)用。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，提供技術(shù)方案如下。

BACE1的基因序列為已知序列，所述基因序列為核苷酸和氨基酸序列表中數(shù)字標(biāo)識符<210>所表示的序列標(biāo)識符1所述的核苷酸序列，即核苷酸序列表中的SEQ?ID?No.1。

與所述BACE1的基因序列對應(yīng)的氨基酸序列為已知序列，所述氨基酸序列為核苷酸和氨基酸序列表中數(shù)字標(biāo)識符<210>所表示的序列標(biāo)識符2所述的氨基酸序列，即核苷酸和氨基酸序列表中的SEQ?ID?No.2。

一種修飾的BACE1，被修飾的位點為SEQ?ID?NO.2所述的氨基酸序列的第203位賴氨酸(Lys203)或/和第382位賴氨酸(Lys382)，所述位點為BACE1與泛素蛋白酶特異性結(jié)合的兩個關(guān)鍵賴氨酸位點。