[發明專利]一種修飾的β-分泌酶及其應用

無效

• 申請號: 201110219988.7
• 申請日: 2011-08-02
• 公開（公告）號: CN102321600A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 慶宏;冉媛媛;王茸;英鄭新;趙娟;鄧玉林;張彥彥;王冉
• 申請（專利權）人: 北京理工大學
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C12N15/57;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12Q1/02;G01N33/573;A61K49/00
• 代理公司: 北京理工大學專利中心 11120
• 代理人: 楊志兵;張利萍

技術領域

本發明涉及一種修飾的β-分泌酶(β-secretase，又稱β-site?amyloid?cleavage?enzyme，BACE)及其應用，具體地說，涉及到利用分子生物學技術得到β-分泌酶1(BACE1)中與泛素蛋白酶特異性結合的兩個賴氨酸位點，并對所述賴氨酸位點進行修飾得到修飾的BACE1氨基酸序列，以及所述氨基酸序列相應的基因序列，還涉及所述修飾的BACE1的應用，屬于生物技術領域。

背景技術

阿爾茨海默病(Alzheimer’s?disease，AD)又稱為老年性癡呆癥，是以進行性認知功能障礙和記憶損害為特征的原發性中樞神經系統退行性疾病，主要發生于老年前期和老年期，目前全世界有3500多萬名患者。AD的病理特征之一是β-淀粉樣蛋白(Aβ)聚積在大腦皮層中細胞外形成老年斑，Aβ是由β-淀粉樣前體蛋白(APP)經過BACE和γ-分泌酶的兩步水解而成。然而，在正常的大腦中Aβ形成極少，在正常生理條件下大部分APP首先在Aβ結構域內被α-分泌酶切割，而不被BACE切割，最終沒有Aβ產生。在某些病理條件下(如APP基因發生突變等)，APP易被BACE作用，于APP氨基端596～597位肽鍵裂解，產生一個N端大片段(sAPPβ)和一個包含有Aβ完整序列的跨膜片段C99；C99再在γ-分泌酶的作用下裂解產生完整的Aβ分子和APP胞內片段。Aβ在大腦中的纖維化進程和蓄積是AD病理的始發因素，APP在BACE酶切位點被水解是產生Aβ的必需前提，因此，BACE在Aβ形成乃至整個AD發病機理中起關鍵作用，人們一直研究如何使用分泌酶抑制劑特異性的阻止Aβ形成，作為治療AD的方法和藥物，但是到目前為止，尚未發現可作為篩選分泌酶抑制劑的有效靶點。

BACE具有BACE1和BACE2兩個同源體。BACE1是一個具有501個氨基酸殘基并與天冬氨酸蛋白酶相關的I型膜蛋白，它主要水解切割APP的β位點產生C99片段，進而產生Aβ，是水解APP生成Aβ產物的關鍵酶。

BACE1廣泛存在于人體內各種組織細胞的高爾基體和內含體中，但在神經細胞中活性最強。BACE1最初是作為未成熟的蛋白前體(分子量約為60KD)在內質網中合成，然后經過一系列加工和修飾快速成熟，成熟的BACE1非常穩定，在培養細胞中的半衰期是9h。BACE1基因的表達具有組織特異性，在海馬、大腦皮層、小腦顆粒神經元和胰島中表達量最高。BACE1是淀粉樣蛋白級聯反應中的限速酶，也是產生Aβ過程中的關鍵調節對象和治療AD的潛在靶點。

BACE1的降解通過兩條途徑進行：泛素-泛素蛋白酶體途徑(Ubiquitin-Proteasomepathway)和溶酶體(lysosomal)途徑。其中BACE1的泛素-泛素蛋白酶體途徑與AD發病機制和大腦的正常老化有關。已有研究證明BACE1的降解和APP的加工處理是由泛素-泛素蛋白酶體途徑調控。

發明內容

針對現有技術中尚未發現可作為篩選分泌酶抑制劑的有效靶點的缺陷，本發明的目的之一是提供BACE1與泛素蛋白酶特異性結合的兩個關鍵賴氨酸位點并提供修飾的BACE1，所述修飾為對所述賴氨酸位點進行缺失、取代或添加。

本發明的目的之二是提供一種編碼所述修飾的BACE1的基因。

本發明的目的之三是提供一種包含編碼所述修飾的BACE1基因的載體。

本發明的目的之四是提供一種包含所述載體的宿主細胞，所述載體為包含編碼所述修飾的BACE1基因的載體。

本發明的目的之五是提供一種篩選所述賴氨酸位點及制備所述修飾的BACE1的方法。

本發明的目的之六是提供所述修飾的BACE1的應用。

為實現本發明的目的，提供技術方案如下。

BACE1的基因序列為已知序列，所述基因序列為核苷酸和氨基酸序列表中數字標識符<210>所表示的序列標識符1所述的核苷酸序列，即核苷酸序列表中的SEQ?ID?No.1。

與所述BACE1的基因序列對應的氨基酸序列為已知序列，所述氨基酸序列為核苷酸和氨基酸序列表中數字標識符<210>所表示的序列標識符2所述的氨基酸序列，即核苷酸和氨基酸序列表中的SEQ?ID?No.2。

一種修飾的BACE1，被修飾的位點為SEQ?ID?NO.2所述的氨基酸序列的第203位賴氨酸(Lys203)或/和第382位賴氨酸(Lys382)，所述位點為BACE1與泛素蛋白酶特異性結合的兩個關鍵賴氨酸位點。