[發明專利]一種修飾的β-分泌酶及其應用

無效

• 申請號: 201110219988.7
• 申請日: 2011-08-02
• 公開（公告）號: CN102321600A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 慶宏;冉媛媛;王茸;英鄭新;趙娟;鄧玉林;張彥彥;王冉
• 申請（專利權）人: 北京理工大學
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C12N15/57;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12Q1/02;G01N33/573;A61K49/00
• 代理公司: 北京理工大學專利中心 11120
• 代理人: 楊志兵;張利萍

1.一種修飾的BACE1，其特征在于：修飾前BACE1的基因為核苷酸和氨基酸序列表中的SEQ?ID?No.1，修飾前BACE1的氨基酸序列為核苷酸和氨基酸序列表中的SEQ?ID?No.2，被修飾的位點為SEQ?ID?NO.2所示氨基酸序列的第203位賴氨酸或/和第382位賴氨酸。

2.根據權利要求1所述的一種修飾的BACE1，其特征在于：所述修飾是指SEQ?ID?NO.2所示氨基酸序列的第203位賴氨酸的缺失、取代或添加。

3.根據權利要求1所述的一種修飾的BACE1，其特征在于：所述修飾是指SEQ?ID?NO.2所示氨基酸序列的第382位賴氨酸的缺失、取代或添加。

4.根據權利要求1所述的一種修飾的BACE1，其特征在于：所述修飾是指SEQ?ID?NO.2所示氨基酸序列的第203位賴氨酸和第382位賴氨酸的缺失、取代或添加。

5.一種編碼如權利要求1～4所述的修飾的BACE1的基因。

6.一種包含如權利要求5所述基因的載體。

7.一種包含如權利要求6所述載體的宿主細胞。

8.一種制備如權利要求1所述修飾的BACE1的方法，所述方法步驟如下：

(1)將BACE1的氨基酸序列分段，每個片段中含有1～3個賴氨酸，構建所述個段片段相應的cDNA，并將所述cDNA分別轉入質粒，得到含cDNA的質粒；

(2)培養細胞，并將所述含cDNA的質粒和含有泛素的質粒共轉染進入所述培養的細胞進行蛋白表達；

(3)用免疫印跡、免疫沉淀和蛋白印跡方法分析所述表達的蛋白，檢測所述細胞中BACE1片段的蛋白水平，以及BACE1片段與泛素蛋白酶之間共定位的情況；

(4)用流式細胞儀檢測所述細胞中泛素化的BACE1片段，分析泛素蛋白酶抑制劑對所述細胞中泛素化的BACE1片段降解的影響；

(5)通過步驟(3)和(4)分析得到與泛素蛋白酶結合的BACE1片段，對與泛素蛋白酶結合的BACE1片段進行定點基因位點突變，篩選并驗證所述BACE1片段中與泛素蛋白酶特異性結合的關鍵賴氨酸位點；

(6)對步驟(5)得到的關鍵賴氨酸位點的基因進行定點基因位點缺失，翻譯得到修飾的BACE1，驗證所述關鍵賴氨酸位點對BACE1泛素化的影響。

9.一種如權利要求1～4所述修飾的BACE1在體外細胞模型或體內轉基因動物中作為影響APP的加工處理，特異性調控Aβ形成的藥物的應用。

10.一種如權利要求1～4所述修飾的BACE1在體外或體內篩選BACE1抑制劑中的應用以及在制備或篩選治療AD的藥物中的應用。