[發明專利]一種利用抗氧化劑篩選牛核移植供體細胞的方法

有效

• 申請號: 201110218955.0
• 申請日: 2011-07-30
• 公開（公告）號: CN102899353A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 易建明;趙玲玲;宋海泉;楊利國;陶林林
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/873
• 分類號: C12N15/873;C12N5/071
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術領域

本發明涉及動物生殖生理與生物技術領域。具體涉及牛體細胞核移植中供體細胞的選擇方法。

背景技術

目前核移植的效率平均不到10％。體細胞核移植效率的提高，有賴于各環節的進一步完善，而供體細胞的準備是核移植關鍵的一步。供體細胞的來源和種類，不同發育階段的供體核，以及供體細胞體外培養的代數和供體細胞來自個體的年齡等的不同，其核移植效果都存在著很大差異。

當前一些研究是從細胞的代數上進行選擇，研究結果尚無定論(高國龍，牛體細胞克隆中供體和受體細胞制備及重構胚構建的影響因素研究；博士論文，2007)，但是在目前很多核移植研究中，大多數使用的是傳代次數較少的細胞，一般為4-6代，很多學者認為這類細胞利于核移植胚的發育。在注入受體細胞前，供體細胞的體外傳代培養，極有可能造成遺傳損傷。所以，研究者們一般采用短期培養的細胞(10代以內)做核供體，不過也有例外，Kubota等用成年牛體細胞傳至10和15代的細胞進行克隆的重構胚發育率比傳5代的高，并且只有傳至10和15代的細胞進行克隆得到了克隆牛犢。這個明顯不同的研究結果可能是與供體動物年齡和供體細胞體外培養的時間長短有很大關系，也可能是由于不同細胞系在分化過程中上產生競爭的差異引起的。但理論傾向于原代細胞(十代以內)作為核供體較好。

還有些研究是從細胞的來源上進行選擇，如牛的卵丘細胞，輸卵管上皮細胞跟成纖維細胞比較前兩者克隆囊胚率較高(Kato?Y，et?al.Eight?calves?cloned?from?somatic?cells?of?a?single?adult.Science，1998，282：2095.Kato?Y，et?al.Cloning?of?calves?from?various?somatic?cell?types?of?male?and?female?adult，new?born?and?fetal?cows.J?Reprod?Fertil，2000，120：231)，但是材料的獲得會涉及動物的屠宰或對動物體傷害較大的手術，在科技日益發達和動物福利日益提高的今天，我們并不提倡用前兩種材料。用牛耳組織成纖維細胞，不但對牛的傷害較小，改善細胞培養技術后還可相應的提高克隆形成率，是值得推廣的技術。

活性氧(Reactive?Oxygen?Species，ROS)又被稱為三原子氧，是在自然界普遍存在的，它是氧的代謝產物和一些氧化還原反應產生的含氧物質的總稱(Kalghatgi，Fridman?et?al，2009)。生物體內的ROS可通過機體酶系統和非酶系統產生的內源性活性氧，也可來自環境的外源性活性氧。體內ROS可在很多反應過程中產生(Miranda，Purdie?et?al.)。

在有機體組織的正常氧化代謝過程中產生的ROS，通常通過組織內部的防御機制來維持平衡。但是在一些損傷因素的作用下，細胞中抗氧化保護機制不足時，細胞內的氧化代謝物增加，使ROS產生堆積并對細胞產生毒性。在體外培養的情況下，我們可以人為的加入一定量的抗氧化劑(Antioxidants)，使細胞免于氧化應激和一些可控制的氧化損傷，使細胞保持更強的活力，更好的傳代培養，以供我們的后續研究。

目前研究中所用的抗氧化劑主要分為兩類：酶類抗氧化劑主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、牛磺酸、亞牛磺酸等和非酶類抗氧化劑主要包括維生素C(VC)、維生素E(VE)、β-巰基乙醇(2-巰基乙醇，β-mercaptoethanol，β-ME)，氮-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)，谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、褪黑素(Melatonin，MLT)、類胡蘿卜素(Carotenoid)、α-硫辛酸(α-Lipoic?acid)、微量元素銅、鋅、硒(Se)等(Sakamoto，Munemura?et?al，2008)。

有研究證實，在體外培養動物體細胞時，在培養過程中添加抗氧化劑能夠提高細胞的抗氧化能力。Zhou等考察了抗氧化劑對鼠角質細胞體外培養壽命的影響。試驗發現在角質細胞的體外培養過程中添加抗氧化劑有利于延長細胞的壽命，其中效果最好的是巰基乙醇，其次為CAT和SOD，試驗還發現，添加抗氧化劑可在一定程度上提高角質細胞的克隆形成率，減緩細胞衰老速率，利于細胞的生長(Zhou?T?et?al，2002)。而將β-巰基乙醇用于牛供體細胞的培養現在還未發現。

發明內容