[發明專利]一種利用抗氧化劑篩選牛核移植供體細胞的方法

有效

• 申請號: 201110218955.0
• 申請日: 2011-07-30
• 公開（公告）號: CN102899353A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 易建明;趙玲玲;宋海泉;楊利國;陶林林
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/873
• 分類號: C12N15/873;C12N5/071
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

1.一種篩選牛核移植供體細胞的方法，其特征在于以下步驟：

1)剪取牛耳尖端4-5cm²的組織，利用接種法培養得到牛耳組織成纖維細胞；

2)在步驟1)的細胞傳至2、6、13、20代時分別測定細胞活力，即MTT?OD值；

3)挑選細胞活力OD值為0.609±0.053的第六代的細胞，備用；

4)用濃度為100μmol/L的β-巰基乙醇處理步驟所得的細胞24h的細胞作為供體細胞；

5)取牛卵母細胞在成熟培養液中培養至成熟，備用；

6)將步驟5)的牛卵母細胞作為受體，進行核移植，觀察并記錄重構胚的卵裂率和囊胚率；

其中：

上述試劑的組分及配制方法如下

細胞培養液-1和細胞培養液-2；

細胞培養液-1：胎牛血清10ml，青霉素-鏈霉素抗菌液1ml，用杜貝柯氏最小必需培養液定容至100ml；

細胞培養液-2：胎牛血清20ml，青霉素-鏈霉素抗菌液1ml，用杜貝柯氏最小必需培養液定容至100ml；

抗氧化劑培養液：向細胞培養液-1中添加β-巰基乙醇，其濃度分別為0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、和150μmol/L，過濾除菌，4℃下保存；

成熟培養液：TCM199?26ml；胎牛血清3.0ml；促卵泡激素15μg；促黃體素150ng；雌二醇30μg；表皮生長因子150ng；丙酮酸鈉6.6mg；青霉素-鏈霉素抗菌液0.3ml；過濾滅菌，4℃下保存；

胚胎培養液：肌醇0.015g；必須氨基酸900μl；非必需氨基酸300μl；牛血清白蛋白0.09g；青霉素-鏈霉素抗菌液300μl；丙酮酸鹽600μl；Stock?G30μl；Stock?C28ml；過濾滅菌，4℃下保存；

各種鹽溶液的配制：

Stock?A：NaCl1.267g；KCl0.107g；KH₂PO₄0.032g；MgSO₄·7H₂O0.036g；青霉素-鏈霉素抗菌液0.2ml；Na-Lactate0.12ml；H₂O19.5ml；

Stock?B：NaHCO₃0.21g；H₂O10ml；

Stock?D：CaCl₂·2H₂O0.262g；H₂O10ml；

Stock?G：L-Glucose0.292g；H₂O10ml；

Stock?C：STOCK?A1.1ml；STOCK?B1.0ml；STOCK?D0.1ml；H₂O7.9ml。