[發(fā)明專利]小球藻突變株及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110218479.2
• 申請日: 2011-07-22
• 公開（公告）號: CN102888347A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發(fā)明（設計）人: 王艷;秦松
• 申請（專利權）人: 中國科學院煙臺海岸帶研究所
• 主分類號: C12N1/12
• 分類號: C12N1/12;C12N15/01;C12P7/64;C12R1/89
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

1.一種小球藻突變株，其特征在于：小球藻突變株已于2011年5月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，編號為CGMCC?No.4917。

2.一種權利要求1所述的小球藻突變株的應用，其特征在于：所述小球藻突變株為單細胞油脂高脂突變株，可應用于生物柴油生產(chǎn)工藝中。

3.按權利要求2所述的小球藻突變株的應用，其特征在于：所述小球藻突變株的篩選過程：

1)將在Kuhl培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的小球藻(Chlorella?kessleri)采用EMS化學誘變處理；

2)將步驟1)誘變處理后藻體轉接培養(yǎng)在高脂定向篩選平板上，篩選出體積增大的單細胞藻體進行擴種繼代培養(yǎng)；

3)將上述擴種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻體進行誘導培養(yǎng)6-20天，待用；

4)取步驟3)藻體利用氣相色譜(GC)測定其脂含量以及測定野生株的脂含量，突變株的脂含量與野生株的脂含量的比值大于110％，即突變株為單細胞油脂高脂突變株；其高脂突變株已于2011年5月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，編號為CGMCC?No.4917。

4.按權利要求3所述的小球藻突變株的應用，其特征在于：所述步驟1)將小球藻接種到Kuhl培養(yǎng)基中，在溫度為18-35℃，轉速為100-200rpm，光照強度為20-150μmol?m^-2?s^-1連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，在培養(yǎng)至對數(shù)生長期的每毫升藻體內(nèi)加入10-100μl?EMS溶液，在黑暗條件下以18-35℃處理15-180min，而后加入EMS溶液等體積的硫代硫酸鈉溶液終止誘變反應；

所述Kuhl培養(yǎng)基為：10g/L葡萄糖、1g/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9.3mg/LEDTA、6.9mg/L七水硫酸亞鐵、14.7mg/L??水氯化鈣、0.29mg/L七水硫酸鋅、0.17mg/L一水硫酸錳、0.06mg/L硼酸、0.002mg/L五水硫酸銅、0.012mg/L四水鉬酸銨，pH?6.5。

5.按權利要求3所述的小球藻突變株的應用，其特征在于：將誘變處理后藻體洗滌后涂布到高脂定向篩選平板上，置于18-35℃的恒溫培養(yǎng)箱中無光靜置培養(yǎng)，篩選單細胞體積增大的藻體于Kuhl培養(yǎng)基中，在溫度為18-35℃，轉速為100-200rpm，光照強度為20-150μmol?m^-2?s^-1連續(xù)光照的搖床中振蕩擴種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

6.按權利要求3所述的小球藻突變株的應用，其特征在于：將擴種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻體中加入50％葡萄糖母液至終濃度為30-60g/L，誘導培養(yǎng)6-20天，使藻細胞內(nèi)脂的大量合成，而后用去離子水3000g低溫離心洗滌，去除上清，藻泥沉淀進行真空冷凍干燥處理24h，得到干藻粉。

7.按權利要求3或6所述的小球藻突變株的應用，其特征在于：將誘導培養(yǎng)后藻體中加入甲苯、1％硫酸—甲醇和十九烷酸(C19:0)內(nèi)標液混合均勻后，置于50-60℃振蕩水浴過夜；取出，冷卻后，加入5％NaCl水溶液和正己烷，混合均勻后，離心收集上層液體，向收集的上層液中加入2％KHCO₃水溶液混合均勻，漩渦儀上混勻離心收集上層液體，用氮氣吹干溶劑后，用正己烷定容，利用氣相色譜(GC)測定突變株中脂含量。

8.按權利要求3所述的小球藻突變株的應用，其特征在于：所述氣相色譜條件為：采用分流模式，以氮氣為載氣；進樣口溫度為250℃；FID檢測器溫度為260℃；柱溫箱的溫度為以2.5℃/min的升溫速率從140℃升至240℃。