[發(fā)明專利]小球藻突變株及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110218479.2
• 申請日: 2011-07-22
• 公開（公告）號: CN102888347A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發(fā)明（設計）人: 王艷;秦松
• 申請（專利權）人: 中國科學院煙臺海岸帶研究所
• 主分類號: C12N1/12
• 分類號: C12N1/12;C12N15/01;C12P7/64;C12R1/89
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發(fā)明涉及一種經(jīng)選育的用以生產(chǎn)單細胞油脂及生物柴油的小球藻突變株及其應用。

背景技術

生物柴油突出的環(huán)保性和可再生性引起了世界發(fā)達國家尤其是資源貧乏國家的高度重視。生物柴油主要以生物脂為原料，經(jīng)酯化反應轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯而得。生物柴油產(chǎn)生的二氧化碳僅為傳統(tǒng)柴油的16％到40％，所產(chǎn)生的尾氣微粒排放量也降低了30％左右，同時不需要對現(xiàn)有柴油發(fā)動機作任何改裝即可混合或單獨使用，也不需要改變能源的分配方式以及能源資源的市場，可直接作為民用燃料和內(nèi)燃機燃料。

生物柴油的生物脂原料主要來源于植物油脂、廢油和動物脂肪。其中以產(chǎn)脂微藻作為原料制備生物柴油，具有其他產(chǎn)脂生物無法比擬的優(yōu)勢：(1)微藻很容易繁殖并且培養(yǎng)的時間短，一般高等植物需要生長好幾個月甚至幾年才能完成一代，微藻繁殖一代的時間僅為2-5天；(2)微藻不像高等植物那樣受氣候、季節(jié)變化的影響，可保持純培養(yǎng)，一年四季都可連續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)，可保證原料供應充足；(3)微藻的生長繁殖是在水域中，不依靠土壤，可以在占地有限的設備上進行而得到高產(chǎn)，不與糧爭地；(4)藻類所需酯化反應的條件相對較低，使生產(chǎn)成本降低，煉制工藝相對較為簡單。

雖然產(chǎn)脂微藻是目前最好的生物柴油工業(yè)生產(chǎn)來源，但它的含油量不高，導致大規(guī)模培養(yǎng)微藻生產(chǎn)油脂成本昂貴，最終使得利用微藻制備生物柴油難以獲得經(jīng)濟效益，產(chǎn)業(yè)化進程減緩。提高微藻細胞的油脂含量是目前降低成本的關鍵，有望從根本上解決生物柴油產(chǎn)業(yè)成本過高的瓶頸問題。因此，一直需要努力不懈的研究，以開發(fā)出產(chǎn)脂量及生物量更高的優(yōu)良藻株，為單細胞油脂及生物柴油的工業(yè)生產(chǎn)提供具有競爭力的原材料。

為了提高微藻細胞的產(chǎn)脂量，過去的研究主要集中在以下幾個方面：(1)培養(yǎng)基優(yōu)化；(2)培養(yǎng)過程控制；(3)代謝工程方法改造藻株；(4)誘變選育高脂突變株。前兩種方法雖然可在一定程度上有效促進藻細胞的產(chǎn)脂量，但提高的百分比數(shù)有限(通常提高20％以下)，仍無法滿足產(chǎn)業(yè)化規(guī)模開發(fā)的要求。代謝工程方法改造微藻是解決藻細胞脂含量低的根本方法，需要全面考慮藻株的整體代謝網(wǎng)絡的結構和調(diào)控特點，有待進一步進行研究。誘變育種方法研發(fā)成本低，選育過程簡單、耗時少，是提高微藻細胞產(chǎn)脂量的有效途徑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種小球藻突變株及其應用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：

一種小球藻突變株：小球藻突變株已于2011年5月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，編號為CGMCC?No.4917，分類名稱小球藻Chlorella?kessleri。

小球藻突變株的應用：所述小球藻突變株為單細胞油脂高脂突變株，可應用于生物柴油生產(chǎn)工藝中。

所述小球藻突變株的篩選過程：

1)將在Kuhl培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的小球藻(Chlorella?kessleri)采用EMS化學誘變處理；將小球藻接種到Kuhl培養(yǎng)基中，在溫度為18-35℃，轉(zhuǎn)速為100-200rpm，光照強度為20-150μmol?m^-2?s^-1連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，在培養(yǎng)至對數(shù)生長期的每毫升藻體內(nèi)加入10-100μl?EMS溶液，在黑暗條件下以18-35℃處理15-180min，而后加入EMS溶液等體積的硫代硫酸鈉溶液終止誘變反應；

所述Kuhl培養(yǎng)基為：10g/L葡萄糖、1g/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9.3mg/LEDTA、6.9mg/L七水硫酸亞鐵、14.7mg/L二水氯化鈣、0.29mg/L七水硫酸鋅、0.17mg/L一水硫酸錳、0.06mg/L硼酸、0.002mg/L五水硫酸銅、0.012mg/L四水鉬酸銨，pH?6.5。

2)將步驟1)誘變處理后藻體轉(zhuǎn)接培養(yǎng)在高脂定向篩選平板上，篩選出體積增大的單細胞藻體進行擴種繼代培養(yǎng)；即將誘變處理后藻體洗滌后觀測其細胞濃度，根據(jù)細胞數(shù)將藻體稀釋10³-10⁶倍，分別涂布到高脂定向篩選平板上，置于18-35℃的程控恒溫培養(yǎng)箱中無光靜置培養(yǎng)，篩選單細胞體積增大的藻體于Kuhl培養(yǎng)基中，在溫度為18-35℃，轉(zhuǎn)速為100-200rpm，光照強度為20-150μmol?m^-2?s^-1連續(xù)光照的搖床中振蕩擴種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期。