[發(fā)明專利]一種阿霉素與膜聯(lián)蛋白V偶聯(lián)物及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110217929.6
• 申請日: 2011-08-01
• 公開（公告）號: CN102294018A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 華子春;謝德
• 申請（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號: A61K38/17
• 分類號: A61K38/17;A61K31/704;A61P35/00
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 胡錫瑜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及阿霉素與膜聯(lián)蛋白V的偶聯(lián)物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

阿霉素是一種蒽環(huán)類抗生素，用于治療急性白血病、惡性淋巴瘤、乳腺癌、骨肉瘤及軟組織肉瘤、肺癌等癌癥，抗癌譜比較廣。周密等人（Zhou,?M.等人，2008，復(fù)旦學(xué)報*醫(yī)藥版，35:793-798）研究發(fā)現(xiàn)阿霉素是通過內(nèi)源性的caspase-3途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。阿霉素對正常細(xì)胞也發(fā)生作用，造成很大的毒副作用，主要表現(xiàn)為心肌毒性、骨髓抑制和神經(jīng)毒性。阿霉素對心肌組織的親和力明顯高于其他組織，造成心肌毒性。由于阿霉素對于腫瘤靶向性差、因此藥物的副作用大。如何提高阿霉素對于腫瘤細(xì)胞的靶向性成為阿霉素臨床應(yīng)用的一個重大難題。

膜聯(lián)蛋白V是一種人體內(nèi)源性蛋白，屬于Ca^?2?+依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族，能與磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，它具有抗凝及抗炎的作用。近年來還發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白V具有抗腫瘤的作用。在腫瘤生長的過程中，腫瘤細(xì)胞會產(chǎn)生表面富含磷脂酰絲氨酸的微泡，微泡中含有可以促進(jìn)腫瘤血管新生的表皮生長因子受體等物質(zhì)。膜聯(lián)蛋白V通過阻止這些微泡與腫瘤血管上皮細(xì)胞的融合，從而抑制了腫瘤血管新生和腫瘤的生長。膜聯(lián)蛋白V蛋白在體內(nèi)可以與帶有外翻的磷脂酰絲氨酸的腫瘤細(xì)胞結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容

為了提高阿霉素對于腫瘤細(xì)胞的靶向性和抗腫瘤活性，本發(fā)明的目的在于提供一種提高阿霉素抗腫瘤活性的方法及其制備方法，以及在制備抗腫瘤藥物上的應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種膜聯(lián)蛋白V與阿霉素的偶聯(lián)物，其中膜聯(lián)蛋白V是指具有與磷脂酰絲氨酸結(jié)合能力的野生型膜聯(lián)蛋白V及其突變體或者截短體分子。

上述膜聯(lián)蛋白V與阿霉素偶聯(lián)物的制備方法，可以通過下述步驟進(jìn)行：

（1）膜聯(lián)蛋白V活化：?將膜聯(lián)蛋白V溶解，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基磺酸基琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS），EDC能夠?qū)⒑恤然姆肿雍秃邪被姆肿优悸?lián)，加入不同濃度Sulfo-NHS用以增強(qiáng)偶聯(lián)效果。

（2）活化反應(yīng)中止：?加入2-巰基乙醇中和未反應(yīng)的EDC。

（3）濃縮中間產(chǎn)物：?用截留分子量為10KD的超濾管離心濃縮中間產(chǎn)物溶液。

（4）偶聯(lián)反應(yīng)：?將鹽酸阿霉素飽和溶液與濃縮后的膜聯(lián)蛋白V活化中間產(chǎn)物混合，室溫攪拌反應(yīng)。反應(yīng)后，體系中產(chǎn)生偶聯(lián)物的絮狀沉淀。

（5）膜聯(lián)蛋白V-阿霉素偶聯(lián)物的溶解與純化：?用含8M尿素的溶液溶解反應(yīng)體系中產(chǎn)生的偶聯(lián)物絮狀沉淀，然后用0.1?M磷酸鈉溶液稀釋產(chǎn)物溶液，并反復(fù)進(jìn)行濃縮和重復(fù)稀釋過程，直至濾過液中檢測不到游離阿霉素為止。

上述膜聯(lián)蛋白V與阿霉素偶聯(lián)物的檢測方法，可以通過下述步驟進(jìn)行：

偶聯(lián)物中的膜聯(lián)蛋白V的濃度使用Bradford法測定蛋白質(zhì)含量，偶聯(lián)物中的阿霉素含量使用紫外吸光光度法測量，根據(jù)朗伯-比爾公式計算。將偶聯(lián)物、膜聯(lián)蛋白V、阿霉素和濾過液分別進(jìn)行紫外-可見吸收光譜分析，掃描范圍為190～700?nm。

上述制備的偶聯(lián)物可以用以制備抗腫瘤藥物。