[發(fā)明專利]一種微生物基因克隆的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110216425.2
• 申請日: 2011-07-29
• 公開（公告）號: CN102899313A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭海;張靜;章偉雄
• 申請（專利權(quán)）人: 江漢大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京三高永信知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11138
• 代理人: 孟阿妮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于遺傳學(xué)領(lǐng)域，公開了一種微生物基因克隆方法。

背景技術(shù)

自然界微生物種類極其復(fù)雜，有細(xì)菌、真菌、病毒等各種種類，寄主也包括人、動物、植物等。對人類而言，微生物基因功能豐富多樣，有好有壞，比如，根瘤菌與豆科植物共生形成根瘤，在固氮酶基因的幫助下固定空氣中的氮?dú)夤┲参餇I養(yǎng)，可減少化肥的施用、保護(hù)環(huán)境。然而，由Magnaporthe?grisea中的毒性基因引起的稻瘟病是水稻上最嚴(yán)重的真菌病菌病害之一，可造成水稻減產(chǎn)30％左右，甚至絕收，嚴(yán)重威脅國家糧食安全。因此，克隆微生物的毒性基因、耐藥性基因等，對了解并利用微生物的這些特性為人類服務(wù)至關(guān)重要。

克隆微生物基因的方法較多，但主要還是按照經(jīng)典的連鎖標(biāo)記定位，然后克隆的方式進(jìn)行。分子標(biāo)記連鎖定位策略源于摩爾根的連鎖理論，即染色體上相鄰基因(即基因連鎖)不能自由分離，而是傾向于整體向后代傳遞，它們所控制的性狀也傾向于同時出現(xiàn)。二者相鄰越近，性狀同時出現(xiàn)的可能性越大，重組性狀越少。因此，由重組性狀(配子)的比例可以度量二者間的距離。若已知道其中一個基因在染色體上的位置(稱這樣的基因?yàn)闃?biāo)記基因)，就可以根據(jù)重組率推斷另一個基因的位置。例如，黃色圓粒豌豆品種(基因型分別為YYRR)與綠色皺粒品種(基因型為yyrr)雜交產(chǎn)生F₁(基因型YyRr)，F(xiàn)₁自交可能產(chǎn)生YR、Yr、yR和yr?4種配子，根據(jù)F₂代的性狀表現(xiàn)可以得知它們的比例，進(jìn)而計算交換率。若交換率為1％，且已知控制顏色的Y基因位于第3染色體上，就可以推測，控制豌豆籽粒形狀的R基因位于第3染色體且與Y基因相距1CM。從以上的分析可以看出，經(jīng)典連鎖標(biāo)記定位的實(shí)質(zhì)是找到與目標(biāo)性狀連鎖的已知分子標(biāo)記，并計算二者的交換率，進(jìn)而推斷目標(biāo)基因的位置。分離群體分池是基因定位的實(shí)際操作策略，仍以上述實(shí)例進(jìn)行說明。以籽粒形狀為標(biāo)準(zhǔn)，將F₂群體劃分為兩個部分(池)：顯性池(隨機(jī)抽取的圓粒單株)和隱性池(隨機(jī)抽取的皺粒單株)，比較豌豆基因組上已知了1000個SSR標(biāo)記(SSR1-SSR1000)擴(kuò)增產(chǎn)物在這兩個池間的差異。若標(biāo)記SSR17與籽粒形狀R/r連鎖，那么對籽粒形狀分池，也就相當(dāng)于對SSR17分池，因此，SSR17在兩個池間的擴(kuò)增產(chǎn)物是有差異的，相反就沒有差異，由此確定目標(biāo)基因與SSR17處于同一染色體。再分析F₂各個單株的表現(xiàn)，計算R/r與SSR17的遺傳距離，即可進(jìn)一步定位R/r在該染色體上的具體位置。

分子標(biāo)記連鎖定位并克隆基因經(jīng)過幾十年的發(fā)展，已成為基因克隆的經(jīng)典方法，但該方法依舊存在明顯缺陷，主要表現(xiàn)如下：

(1)微生物個體小，觀察與鑒定工作十分困難且主觀性強(qiáng)。然而，連鎖標(biāo)記定位要求鑒定分離群體中每一菌株的表現(xiàn)型，工作量十分繁雜且難度大。

(2)目前針對微生物所開發(fā)的分子標(biāo)記有限，使其應(yīng)用受到很大限制；精細(xì)定位時，可用標(biāo)記越來越少，甚至無標(biāo)記可用，使工作無法進(jìn)行，即使存在標(biāo)記，由于交換率低，需分離與鑒定大量菌株才能準(zhǔn)確獲得的遺傳距離，工作量呈幾何級數(shù)增加；僅找到包含目標(biāo)基因的區(qū)段，還需要進(jìn)行基因預(yù)測，無法避免基因預(yù)測的假陽性或假陰性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明實(shí)施例的目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種能夠準(zhǔn)確、快速、輕松克隆微生物目標(biāo)基因的新方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種微生物基因克隆方法，包括以下步驟：

用目標(biāo)性狀(如毒性、耐藥性、溫度敏感性等)有差異的菌株做親本，通過雜交構(gòu)建分離群體，通過抗性植株、農(nóng)藥、溫度、營養(yǎng)元素等條件對分離群體設(shè)置選擇壓進(jìn)行自動篩選，獲得篩選后群體；對兩個親本、篩選前和篩選后群體進(jìn)行基因組高通量測序；通過初步de?novo(直接)組裝并比對，獲得親本間差異位點(diǎn)，并將親本間差異位點(diǎn)與篩選前和篩選后的群體基因組按完全匹配的方式進(jìn)行比對，尋找在親本與篩選前群體中存在、但在篩選后群體中消失的位點(diǎn)，該位點(diǎn)為控制目標(biāo)性狀的基因；通過與親本基因組比對獲得目標(biāo)基因的全長序列，并利用PCR擴(kuò)增克隆目標(biāo)基因，按遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所克隆目標(biāo)基因的功能。

本發(fā)明更具體的技術(shù)方案是：

一種微生物基因克隆方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建分離群體：利用分別含有相對性狀(如毒性、耐藥性、溫度敏感性等)的親本雜交后分離構(gòu)建分離群體；