[發明專利]一種微生物基因克隆的方法

有效

• 申請號: 201110216425.2
• 申請日: 2011-07-29
• 公開（公告）號: CN102899313A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 彭海;張靜;章偉雄
• 申請（專利權）人: 江漢大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 孟阿妮

1.一種微生物基因克隆方法，其特征在于，包括以下步驟：用目標性狀有差異的菌株做親本，通過雜交構建分離群體；通過抗性植株、農藥、溫度、營養元素對分離群體設置選擇壓進行自動篩選，獲得篩選后群體；對兩個親本、篩選前和篩選后群體進行基因組高通量測序；通過初步直接組裝并比對，獲得親本間差異位點，并將親本間差異位點與篩選前和篩選后的群體基因組按完全匹配的方式進行比對，尋找在親本與篩選前存在、但在篩選后消失的位點，該位點為控制目標性狀的候選基因位點；通過與親本基因組比對獲得基因的全長序列，并利用PCR擴增克隆目標基因，按遺傳互補實驗驗證所克隆目標基因的功能。

2.根據權利要求1所述的微生物基因克隆方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)構建分離群體：利用分別含有相對性狀的親本雜交后分離構建分離群體；

(2)群體自動篩選：按目標性狀的特點，選擇適合類型的選擇壓，對分離群體進行自動篩選，獲得篩選后群體；

(3)DNA提取：提取2個親本、篩選前和篩選后2個混合群體的基因組DNA；

(4)目標位點的確定：按高通量測序流程分別構建親本、篩選前和篩選后基因組DNA文庫，PCR并高通量測序；按直接組裝，初步構建2個親本全基因組，通過比對，獲得親本間差異位點；按完全匹配的方式，將差異位點與篩選前和篩選后的混合基因組進行比對，獲得在親本和篩選前群體中存在、但在篩選后群體中消失的位點，該位點為控制目標性狀的候選基因位點，若候選基因位點為多個，采用PCR或雜交方式在篩選前和篩選后的群體DNA中富集候選位點，對候選位點重測序，最終確定目標基因；

(5)目標基因克隆與功能驗證：通過比對親本基因組的方式獲得基因的全長序列，PCR擴增克隆目標基因，按通用的遺傳互補實驗驗證所克隆基因的功能。