[發(fā)明專利]斜紋夜蛾基因工程病毒3號(hào)及其構(gòu)建方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110216417.8
• 申請(qǐng)日: 2011-07-30
• 公開（公告）號(hào): CN102329783A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱江;浦冠勤;郭大磊;王文兵;湯欣欣;孫興魯;秦啟聯(lián)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N7/01
• 分類號(hào): C12N7/01;C12N15/63;C12R1/93
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 陶海鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種能夠防治斜紋夜蛾等農(nóng)林害蟲的斜紋夜蛾基因工程病毒，屬微生物技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

斜紋夜蛾是農(nóng)作物的主要害蟲之一，我國各省區(qū)均有分布。該蟲食性極廣，已知可危害的寄主植物達(dá)99科290多種。近年來隨著農(nóng)業(yè)耕作制度的改變和城市化進(jìn)程的快速發(fā)展，蔬菜、花卉、綠化草坪等旱地作物的種植面積越來越多，斜紋夜蛾的為害也日益猖獗。當(dāng)前生產(chǎn)上采用的化學(xué)防治往往達(dá)不到預(yù)期效果，而且容易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和人畜中毒等。?

隨著國民經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展和人民生活水平的日益提高，人們對(duì)于各種農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量要求越來越高，特別是產(chǎn)品的安全性問題已受到廣泛的關(guān)注和重視。目前，在各種農(nóng)作物病蟲害的防治工作中，過度依賴化學(xué)農(nóng)藥的情況仍然十分嚴(yán)重，由此帶來了害蟲抗性、再猖獗和環(huán)境污染等問題，直接影響到人類的食品安全和生存環(huán)境。因此，大力發(fā)展高效、廣譜、與環(huán)境相容性好的無公害生物農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要。?

斜紋夜蛾多粒包埋核型多角體病毒(Spodoptera?litura?multicapsid?nucleopolyhedrovirus，以下簡稱野生型病毒或SpltMNPV)已用于斜紋夜蛾的防治。但由于它存在殺蟲速度慢的缺陷，影響了其推廣應(yīng)用。為了改變野生型昆蟲桿狀病毒殺蟲速度慢的缺陷，上世紀(jì)90年代以來，國內(nèi)外已有多種重組昆蟲桿狀病毒問世，如文獻(xiàn)報(bào)道了美國的重組苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(rAcMNPV?Stewart?L?M?D?et?al?1991.Nature,352:85-88)、中國發(fā)明專利（CN?1109105C）公開的重組棉鈴蟲核型多角體病毒(rHaSNPV?)等。但迄今為止，國內(nèi)外尚未見插入昆蟲神經(jīng)毒素基因的斜紋夜蛾核型多角體基因工程病毒構(gòu)建成功。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種能有效提高野生病毒殺蟲速度和效果的斜紋夜蛾核型多角體基因工程病毒及其構(gòu)建方法。?

本發(fā)明的目的是按下述方案實(shí)現(xiàn)的：?

一種斜紋夜蛾基因工程病毒，對(duì)野生型病毒SpltMNPV??進(jìn)行缺失和重組得到，其保藏信息為：保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏單位地址：中國武漢武漢大學(xué)；保藏日期：2011年5月20日；保藏編號(hào)：CCTCC?NO:V201116；分類命名：斜紋夜蛾基因工程病毒3號(hào)(SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-Pie-1-BmK?ITa1)；在其基因組中缺失了egt基因即蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，在缺失egt基因的位點(diǎn)處，插入由野生型病毒即早期基因（ie-1）啟動(dòng)子控制的東亞鉗蝎毒BmK?ITa1基因和由野生型病毒多角體蛋白基因ph啟動(dòng)子控制的標(biāo)記基因即增強(qiáng)型綠色熒光蛋白egfp基因。

提供一種構(gòu)建上述基因工程病毒的方法，包括以下步驟：?

（1）構(gòu)建重組質(zhì)粒?pSK-Δegt-Pph-?egfp???

以具有毒力的野生病毒?(Spodoptera?litura?nucleopolyhedrovirus?,?SpltMNPV?,?GenBank?登錄號(hào)：NC-011616?)?SpltMNPV??DNA為模板，分別擴(kuò)增出同源重組臂egt上游非編碼端序列Egt?up和?egt?3′端的1055bp序列以及下游非編碼端序列Egt?down；擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后分別經(jīng)Kpn?I?/Xho?I，?Xba?I/?Sac?I雙酶切后依次克隆到載體pBluescript?Ⅱ?SK(+)上，獲得中間質(zhì)粒pSK-?Egtup-?Egtdown；

在上述兩個(gè)片段之間，利用分子克隆技術(shù)插入SpltMNPV?多角體蛋白基因啟動(dòng)子啟動(dòng)Pph控制的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因egfp，獲得重組質(zhì)粒?pSK-Δegt-Pph-?egfp；

（2）構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pSK-Δegt-Pph-?egfp-Pie-1-?BmK?ITa1