[發明專利]斜紋夜蛾基因工程病毒3號及其構建方法

無效

• 申請號: 201110216417.8
• 申請日: 2011-07-30
• 公開（公告）號: CN102329783A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 朱江;浦冠勤;郭大磊;王文兵;湯欣欣;孫興魯;秦啟聯
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/63;C12R1/93
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 陶海鋒

1.?一種斜紋夜蛾基因工程病毒，其特征是對野生型病毒SpltMNPV?????????????????????????????????????????????????進行缺失和重組得到的斜紋夜蛾基因工程病毒3號，其保藏信息為：保藏單位：中國典型培養物保藏中心；保藏編號：CCTCC?NO:V201116；分類命名：斜紋夜蛾基因工程病毒3號(SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-Pie-1-BmK?ITa1)；在其基因組中缺失了egt基因即蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶基因，在缺失egt基因的位點處，插入由野生型病毒即早期基因?ie-1啟動子控制的東亞鉗蝎毒BmK?ITa1基因和由野生型病毒多角體蛋白基因ph啟動子控制的標記基因即增強型綠色熒光蛋白egfp基因。

2.?一種構建如權利要求1所述的斜紋夜蛾基因工程病毒3號（SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-Pie-1-BmK?ITa1）的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）構建重組質粒?pSK-Δegt-Pph-?egfp???

以SpltMNPV??DNA為模板，分別擴增出同源重組臂egt上游非編碼端序列Egt?up和?egt3′端的1055bp序列以及下游非編碼端序列Egt?down；擴增產物回收純化后分別經Kpn?I?/Xho?I，?Xba?I/?Sac?I雙酶切后依次克隆到載體pBluescript?Ⅱ?SK(+)上，獲得中間質粒pSK-?Egtup-?Egtdown；

在上述兩個片段之間，利用分子克隆技術插入SpltMNPV?多角體蛋白基因啟動子啟動Pph控制的增強型綠色熒光蛋白基因egfp，獲得重組質粒?pSK-Δegt-Pph-?egfp；

（2）構建重組轉移載體pSK-Δegt-Pph-?egfp-Pie-1-?BmK?ITa1

?在BmK?ITa1基因前引入AcMNPV?BV膜融合蛋白GP64的同系物，SpltMNPV??F蛋白的信號肽signalP序列，以SpltMNPV??DNA為模板，擴增出signalP序列，并克隆到pBacPAK8上得到pBacPAK8-signalP；將AcMNPV的即早期基因ie-1啟動子克隆到pBacPAK8-signalP中，得到中間質粒pBacPAK8-Pie-1-signalP；

以pMD18-BmK?ITa1為模板，PCR擴增出BmK?ITa1片段并克隆到pBacPAK8-Pie-1-signalP中，得到pBacPAK8-Pie-1-signalP-?BmK?ITa1；

以Sma?I和Xba?I雙酶切，切下Pie-1-signalP-?BmK?ITa1片段并插入到pSK-Δegt-Pph-egfp?中egfp基因和egt3’非編碼端之間，得到重組轉移載體pSK-Δegt-Pph-?egfp-Pie-1-?BmK?ITa1；

（3）共轉染、純化，得到基因工程病毒SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-Pie-1-BmK?ITa1

將Psk-Δegt-Pph-egfp-Pie-1-BmK?ITa1和SpltMNPV?基因組DNA共轉染斜紋夜蛾SpLi細胞，通過基因等位交換，獲缺失egt基因的，以綠色熒光蛋白為標記的，病毒感染早期能表達BmK?ITa1的重組病毒SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-Pie-1-?BmK?ITa1；

經多輪熒光斑法純化，得到純的重組斜紋夜蛾基因工程病毒3號(SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-Pie-1-BmK?ITa1?)。