[發明專利]一種直接從淀粉釀制啤酒的方法及其專用酵母

有效

• 申請號: 201110215758.3
• 申請日: 2011-07-29
• 公開（公告）號: CN102286389A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 王正祥;左志銳;石貴陽;樊游;楊華
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/56;C12N15/63;C12C5/00;C12C11/02;C12R1/865
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一種用液化淀粉直接釀制啤酒的方法及其專用酵母細胞，屬于基因工程和啤酒釀造技術領域。

背景技術

傳統啤酒是以大麥芽為主要原料，添加啤酒花，用啤酒純種酵母進行發酵而生產的一種低酒精度的飲料，之所以用大麥芽為主要原料是因為大麥芽含有供酵母進行新陳代謝所需要的營養成分；且大麥芽含有復雜而又豐富的酶體系可將原料中的淀粉轉化為能被酵母利用的可發酵糖類。由于世界啤酒生產量的連年攀升，麥芽需求量急劇增加。選擇大麥以外的其他原料作為啤酒生產輔料或主要原料來代替大麥具有重要意義，而淀粉作為啤酒行業的主要輔料，價格低廉，是一種很有潛力的生物資源。

啤酒酵母缺少淀粉水解酶類活力，在生長過程中不能利用淀粉，所以在傳統的發酵過程中需要添加麥芽（含有豐富的β-淀粉酶和α-淀粉酶）和/或α-淀粉酶和糖化酶對淀粉質原料（包括麥芽中的淀粉）進行預處理，處理后的麥芽糖/葡萄糖漿方可被釀酒酵母利用。因此，在啤酒酵母中導入外源淀粉酶水解酶類編碼基因，賦予其淀粉水解能力對實現釀酒酵母的同步液化-糖化-發酵、增加底物利用率具有重要意義。

細胞表面工程是一種利用細胞內蛋白轉運到膜表面的機制和原理，把異源蛋白展示在細胞表面的生物工程技術，在保持被展示蛋白或多肽的生物活性的基礎上，將其固定于細胞表面，其原理是將目的蛋白基因序列與定位序列融合后導入微生物宿主細胞，通過定位序列使目標蛋白定位于細胞表面進行表達。本發明所用的定位序列為釀酒酵母細胞α凝集素序列，該表面展示技術具有對環境無不良影響、能使真核蛋白進行有效的分泌和折疊、發酵過程不再需要添加相關外源酶制劑等優點。

本發明用淀粉基本代替或完全代替大麥生產啤酒，淀粉類型不受限制，可以大大節約原料及工藝成本，有著無限的發展前景。本發明構建了穩定的含外源淀粉酶基因的啤酒酵母菌株，且淀粉酶活位于啤酒酵母細胞表面，采用液化淀粉為主要原料，接種該專用的啤酒酵母利用淀粉生產啤酒。

發明內容

本發明目的之一是提供利用專用啤酒酵母基因工程菌直接從液化淀粉發酵生產啤酒的制備方法。

本發明目的之二是提供具有米根霉來源的真菌α-淀粉酶酶活的專用啤酒酵母的構建方法。

將來源于米根霉的真菌α-淀粉酶克隆入表達載體pMGK，將來源于釀酒酵母的α凝集素片段置于真菌α淀粉酶基因下游構建重組表達載體，然后導入啤酒酵母S26中，通過G418抗性平板篩選陽性克隆；將重組菌分別在搖瓶、1?L、15?L罐直接利用淀粉發酵生產啤酒。

本發明的技術方案：

1.構建細胞表面具有米根霉真菌α-淀粉酶酶活的專用啤酒酵母

將來源于米根霉的α-淀粉酶編碼基因，命名為rRoamy，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO:?1，來源于釀酒酵母的α凝集素編碼基因，命名為AG，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO:4，分別與克隆載體pMGK組成的重組質粒pAA-AG轉化入啤酒酵母S26，使其細胞表面具有真菌α-淀粉酶的酶活。該專用啤酒酵母已保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC?NO：M?2011219。

專用啤酒酵母CCTCC?NO：M?2011219的構建，按如下步驟進行：

（1）以米根霉為原料，提取其總RNA，以此為模板，在逆轉錄酶的作用下，合成一鏈cDNA。根據已公布的米根霉α-淀粉酶基因序列設計一對引物，以一鏈cDNA為模板PCR擴增含自身信號肽的完整α-淀粉酶基因rRoamy，其基因編碼為：SEQ?ID?NO:?1（Li?S,?etal.?Appl?Biochem?Biotechnol.2011.）。

所述PCR擴增所用引物為：

AA-F：5’-GCGGGATCCATGAAGTCTTTCTTAAGTCT-3’?，?

AA-R：5’-CACGTCGACTTAGTTCTTTTGGAATATGG-3’?；?

其中在上游引物AA-F的5’端具有BamHI限制性內切酶識別位點，下游引物的AA-R?5’端具有SalI限制性內切酶識別位點。

（2）以釀酒酵母S26染色體為模板，根據已公布的α凝集素序列設計一對引物，通過PCR擴增獲得α凝集素基因AG，其基因編碼為：SEQ?ID?NO:?4。

所述PCR擴增所用的引物為：

AG-F：5’-CCGGTCGACAGCGCCAAAAGCTCTTTTATC-3’?，