[發(fā)明專利]綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法及在魚(yú)糜制品生產(chǎn)中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110215634.5
• 申請(qǐng)日: 2011-07-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102295700A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹敏杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 集美大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/81
• 分類號(hào): C07K14/81;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18;A23L1/326
• 代理公司: 廈門(mén)市新華專利商標(biāo)代理有限公司 35203
• 代理人: 李寧

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法及在魚(yú)糜制品生產(chǎn)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

綠豆胰蛋白酶抑制劑(Mung?Bean?Trypsin?Inhibitor,?MBTI)?是從綠豆(Phaseolus?radiatus?L.)?成熟種子中分離的屬于Bowman-Birk?型絲氨酸蛋白酶抑制劑。我國(guó)學(xué)者戚正武等人深入而系統(tǒng)地研究了MBTI的物理化學(xué)及生物化學(xué)性質(zhì)，測(cè)定了它的一級(jí)結(jié)構(gòu)。MBTI共含72個(gè)氨基酸殘基,?分子量為8,883?Da,含7對(duì)二硫鍵,?對(duì)熱、酸、堿、酶消化的穩(wěn)定性很高。它具有兩個(gè)抑制活力相同的結(jié)構(gòu)域,?兩個(gè)抑制活性位點(diǎn)(Lys20-Ser21,?Arg47-Ser48)?都對(duì)胰蛋白酶起作用。前者由一條含26殘基的長(zhǎng)鏈與含9個(gè)殘基的短鏈通過(guò)兩對(duì)二硫鍵連接而成。而后者由含27個(gè)殘基的單鏈組成。MBTI與酶作用的機(jī)制遵循其它蛋白質(zhì)型絲氨酸蛋白酶抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)抑制機(jī)制。最近的研究發(fā)現(xiàn)，MBTI還具有抗腫瘤等醫(yī)學(xué)作用。

目前，綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化主要采用硫酸抽提、硫酸銨分級(jí)沉淀、膜超濾、離子交換柱層析、親和色譜或高效液相色譜等方法，分離純化過(guò)程繁瑣，操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，得率低，成本高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種工藝簡(jiǎn)單，分離效果好的綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法以及其對(duì)魚(yú)糜制品彈性增強(qiáng)的改善作用。

本發(fā)明的工藝流程設(shè)計(jì)原理是：在低濃度硫酸的作用下，綠豆中部分雜蛋白被酸破壞而降解成小分子物質(zhì)，加熱處理進(jìn)一步去除了雜蛋白。對(duì)酸、對(duì)熱穩(wěn)定的綠豆胰蛋白酶抑制劑（MBTI）則基本不受影響而在離心后的上清液中。膜處理可有效去除大分子（>30?kDa）蛋白和小分子(<5?kDa)的鹽和小肽成分。離子交換層析中，MBTI對(duì)陰離子交換劑的結(jié)合力取決于彼此間相反電荷基團(tuán)的靜電吸引，而這種吸引力與溶液的pH值及鹽濃度有關(guān)。溶液中鹽濃度的變化直接影響陰離子交換劑對(duì)蛋白質(zhì)的吸附能力。故本發(fā)明采用鹽濃度線性梯度洗脫方式對(duì)MBTI進(jìn)行純化。

此外，在魚(yú)糜制品生產(chǎn)過(guò)程中，肌肉中的肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(myofibril-bound?serine?proteinase,?MBSP)是導(dǎo)致魚(yú)糜制品彈性下降的主要因素。將以上方法制備的高純度MBTI或部分純化的MBTI添加到以海水魚(yú)或淡水魚(yú)為主要原料的魚(yú)糜制品中，使其終濃度達(dá)到10-50?mg/kg或以上，攪拌均勻，可使最終制品的凝膠強(qiáng)度增加10-20%，達(dá)到改善魚(yú)糜制品品質(zhì)的效果。

為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的解決方案是：

一種綠豆胰蛋白酶抑制劑(Mung?bean?trypsin?inhibitor,?MBTI)的分離純化方法，包括如下步驟：

1）提取：將干燥的綠豆用粉碎機(jī)粉碎成粉末；以1：4-6?m/v比例溶于硫酸中，攪拌浸泡后，離心取其上清液為MBTI粗提液；

2）中和：向步驟1）所得的MBTI粗提液中加堿至溶液的pH呈中性；

3）熱處理：將步驟2）所得的MBTI粗提液在水浴中加熱，加熱后立即冷卻，離心收集上清液；

4）膜處理：將步驟3）所得的上清液用30?kDa分子量截留的超濾膜超濾后取外液；進(jìn)一步用5?kDa分子量截留的超濾膜超濾脫鹽制得MBTI濃縮液；

5）吸附分離解吸：將步驟4）脫鹽后的MBTI濃縮液經(jīng)Q-Sepharose(購(gòu)于安瑪西亞公司或DEAE-Sepharose陰離子交換樹(shù)脂(購(gòu)于安瑪西亞公司)吸附分離，MBTI吸附在樹(shù)脂上，吸附后的樹(shù)脂經(jīng)梯度淋洗解吸，得到高純度綠豆胰蛋白酶抑制劑（MBTI）。

所述的步驟1）中硫酸濃度為0.05-0.1?mol/L，攪拌浸泡時(shí)間為18-36?h，組織搗碎后，以8000-12000?g離心15-30?min，上清液為MBTI粗提液。

所述的步驟2）中堿采用1-2?mol/L的NaOH。

所述的步驟3）中加熱條件采用60°C，90?min或80°C，30?min或90°C，15?min中的一種；10000-12000?g離心10-15?min，收集上清液為部分純化的綠豆胰蛋白酶抑制劑。

所述的步驟4）中的上清液用?30?kDa分子量截留的超濾膜超濾，截留大分子量蛋白，而分子量較小的MBTI（約9?kDa）則流出到外液；進(jìn)一步用5?kDa分子量截留的超濾膜超濾脫鹽，同時(shí)在超濾液中加入pH?7.5-8.0的20?mmol/L?Tris-HCl緩沖溶液或磷酸緩沖液制得MBTI濃縮液。