[發明專利]一種大分子量T載體及其制備方法

無效

• 申請號: 201110214171.0
• 申請日: 2011-07-28
• 公開（公告）號: CN102304537A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發明（設計）人: 肖愛軍;周磊;赫英俊
• 申請（專利權）人: 上海捷瑞生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 胡美強;沈利

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種大分子量T載體及其制備方法。

背景技術

PCR(polymerase?chain?reaction)是分子生物學中的常規實驗技術。絕大多數情況下需要將PCR擴增產物克隆到質粒載體上，以便對PCR產物進行測序、體外轉錄、體外翻譯等操作。克隆PCR產物的方法有很多種，但最直接的、最方便的方法是TA克隆。所謂TA克隆就是將3’端具有單個A尾巴的PCR產物克隆到3’端具有單個T尾巴的T載體上。TA克隆的理論依據是：在PCR擴增過程中，由于Taq聚合酶具有不依賴于模板的末端轉移酶活性而在PCR產物的3’末端添加單個脫氧核苷酸，并且偏好添加四種脫氧核苷酸中的脫氧腺苷酸，使得50％以上的PCR產物的3’末端具有單個脫氧腺苷酸，即3’端A尾巴。

目前，T載體的制備方法有2種。第一種方法是利用產生平末端的內切酶將環狀質粒酶切成線狀質粒，然后利用末端轉移酶將單個雙脫氧胸腺核苷酸(ddTTP)添加到線狀載體的3’端。第二種方法是在質粒載體的多克隆位點中引入特定的酶切位點，用相應的內切酶酶切產生3’端具有單個T突出的線性T載體。前一種方法在制備T載體過程中存在加尾效率較低以及線性質粒在加尾過程中其兩端的序列有時會被部分刪除等問題。與前兩種方法相比，第二種方法更快捷、更高效以及更穩定。理論上，可以用來制備T載體的內切酶包括XcmI，Eamll05I，其中XcmI在制備T載體中得到廣泛應用。其它內切酶要么因為太昂貴，要么因為在普通的克隆載體上有太多的識別位點，因而在制備T載體中的應用受到限制。在普通含Amp抗性的克隆載體中，例如pUC18、pBlueScript?SK載體等，都不具有XcmI酶切位點，但在Amp抗性基因中含有一個Eamll05I及其同裂酶的酶切位點，因而在這些載體的多克隆位點引入XcmI位點更方便一些，這就是為什么更多人采用XcmI制備T載體(美國專利文獻US005487993A；中國專利文獻CN1142279C，CN1344795A以及CN1362521A)。

使用XcmI構建T載體均存在一個潛在的問題：部分酶切的前T載體混雜在T載體中會導致非重組轉化子的本底過高。目前，解決這一問題最有效的方法是在前T載體的兩個XcmI或兩個XcmI酶切位點之間引入足夠長的間隔DNA，經瓊脂糖凝膠電泳后將完全酶切的質粒和部分酶切的質粒分開。然而，引入間隔DNA后帶來的一個新問題是：由于環形質粒在瓊脂糖凝膠電泳中比起分子量相當的線型質粒移動得快，因而，未被酶切的環型質粒(前T載體，帶有間隔DNA)往往與分子量小于自身的T載體(不帶有間隔DNA)混雜，最終造成非重組轉化子的本底過高。

pBlueScript?II?SK(+/-)載體(GenBank?Accession?No.X52330)是由pUC載體派生而來的噬菌粒載體(phagemid或phasmid)，除了含有一個Amp抗性基因及一個lacZ基因作為篩選標記外，在多克隆位點的兩側存在T3和T7噬菌體的啟動子，同時具有一個單鏈噬菌體f1的復制起點(pBlueScript?II?SK(+)和pBlueScript?II?SK(-)的唯一區別是兩者f1的方向相反)。

ccdB基因(GenBank?Accession?No.AP001918)位于F質粒上，它和ccdA基因一起構成F質粒的ccd(control?or?cell?death)位點。Ccd位點通過殺死不含F質粒的大腸桿菌細胞達到穩定F質粒的作用。CcdB蛋白干擾大腸桿菌的DNA促旋酶，因而抵制大多數大腸桿菌菌株。但是大腸桿菌DB3.1菌株中促旋酶的A亞基基因發生了一處突變，突變后的促旋酶可以抵抗CcdB蛋白的毒性效應，因而含有ccdB基因的質粒要以在DB3.1菌株中增殖。

目前，市場上常用的T載體長度都在2800bp到3100bp之間，對于長度在2500bp至3500bp之間的片段而言，通過酶切得到的片段，很難和該類載體在電泳時長度上做出明顯的區分，不利于后續更換載體等的后續操作，很容易和載體一起回收，最終造成非重組轉化子的本底過高。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，針對目前常用的T載體長度都在2800bp到3100bp之間，對于長度在2500bp至3500bp之間的外源片段的克隆，存在非重組轉化子的本底過高，克隆效率較低的不足，而提供一種克隆2500bp至3500bp片段具有較高TA克隆效率的T載體及其制備方法。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：