[發明專利]檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒

無效

• 申請號: 201110212152.4
• 申請日: 2011-07-27
• 公開（公告）號: CN102305859A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發明（設計）人: 丁壯;黃志強;母連志;吳娟;楊閩楠;張泉鵬
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 王薇

技術領域

本發明涉及一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒，特別是涉及一種能夠區分活毒感染和滅活毒免疫豬群的液相阻斷ELISA制備方法，屬于一種新的動物疫病診斷試劑，應用于畜牧獸醫學領域。本發明具有深遠的研究性和廣泛的應用性，包括對地區內豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行病學調查，以及凈化豬場和區分野毒感染和滅活毒免疫的豬群。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome，PRRS)由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome?virus．PRRSV)感染引起，主要特征為懷孕母豬發生流產、早產和死胎等嚴重的繁殖障礙以及仔豬與育肥豬的呼吸道疾病。PRRS是上世紀80年代后期暴發的一種新的傳染性疾病，于1987年首發于北美地區，在隨后的幾年內，便迅速地在歐、美大陸的許多國家流行，隨后又蔓延至亞洲的一些國家，成世界范圍內的大流行，給全球養豬業造成了巨大的經濟損失。我國自1995年底暴發此病，并迅速傳播至全國各地，成為我國規?；B豬場引發繁殖障礙的主要疫病之一。近年來PRRS呈持續性感染，并導致繼發性感染增加，嚴重威脅了養豬業的發展。

PRRS傳播非常迅速，豬群一旦感染即呈持續性，污染豬場可成為疫源地。雖然PRRSV流行毒株有美洲型和歐洲型，但至今為止，我國分離到的PRRSV流行毒株均為美洲型。由于PRRS與其它許多引起豬繁殖障礙綜合征的疾病(如豬細小病毒病、豬偽狂犬病、豬瘟等)的臨床癥狀相似，不具有特征性，加上RRRSV感染豬群易引起繼發感染，發生細菌性或病毒性繼發感染，更使得臨床表現和病理變化復雜化，豬只個體之間的臨床表現差異很大，而且近年來越來越多的PRRS是亞臨床型和慢性型病例。僅根據臨床癥狀和病變及流行病學特點很難做出診斷，因此PRRS的確診需要借助實驗室診斷技術，特別是新發生本病的地區和豬場。

目前國內外建立了一系列PRRS診斷方法。其中用于PRRSV檢測方法主要有病毒分離、免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)、血清中和試驗(SN)、間接熒光抗體試驗(IFA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、乳膠凝集試驗(LAT)、膠體金技術、單克隆抗體技術、反轉錄．聚合酶鏈式反應(RT—PCR)、套式RT-PCR、實時RT-PCR和核酸探針原位雜交技術(ISH)。上述檢測PRRSV抗體的技術人多針對結構蛋白，而有關PRRSV非結構蛋白抗體的檢測方法還未見報道。

發明內容

??本發明的目的在于提供一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒，其利用固相酶聯免疫吸附試驗（ELISA）原理，以PRRSV非結構蛋白Nsp9為診斷抗原，結合單抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG及其他配套試劑組成。其反應機理為包被抗原和樣品中抗PRRSV?Nsp9抗體結合導致單抗和抗原的結合量減少，通過酶標抗體形成“包被抗原+結合單抗+酶標抗體”復合物，加入顯色劑，通過酶催化反應顯色。顯色深淺與樣品中的檢測抗體含量成反比，當顯色（OD₄₉₀）超過設定的臨界值時結果判為陽性，表明有活毒存在。判定結果是這樣設定的：抑制率PI=(OD_未抑制-OD_樣品)?/OD_未抑制*100%，PI>30%對應的樣品為陽性，小于則為陰性。具有簡單、快速、敏感和特異性好等特點；適用于區分臨床區分豬繁殖與呼吸綜合征病毒活毒和滅活毒抗體。

????本發明的技術方案是這樣實現的：檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒，其特征在于：將96孔ELISA板、樣品稀釋液、20倍濃縮洗滌液、羊抗小鼠IgG-HRP結合物、結合單抗、終止液、底物A、底物B、陽性樣品、陰性樣品、蓋板膜（11）分別用的廣口瓶加以封裝，貼上標簽，組裝成試劑盒，具體組裝方法按以下步驟完成：

???第一步：首先對96孔ELISA板進行包被：96空ELISA板上包被有PRRSV?Nsp9蛋白，用包被緩沖液將Nsp9蛋白稀釋到1.5ug/mL，每孔100ul包被ELISA板，37℃包被1h后用含5%脫脂奶粉的PBS?37℃封閉1h，然后用PBS洗滌5次干燥后用鋁箔真空密封備用；