[發(fā)明專利]檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110212152.4
• 申請日: 2011-07-27
• 公開（公告）號: CN102305859A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁壯;黃志強(qiáng);母連志;吳娟;楊閩楠;張泉鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 吉林長春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 王薇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒，特別是涉及一種能夠區(qū)分活毒感染和滅活毒免疫豬群的液相阻斷ELISA制備方法，屬于一種新的動(dòng)物疫病診斷試劑，應(yīng)用于畜牧獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明具有深遠(yuǎn)的研究性和廣泛的應(yīng)用性，包括對地區(qū)內(nèi)豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行病學(xué)調(diào)查，以及凈化豬場和區(qū)分野毒感染和滅活毒免疫的豬群。

背景技術(shù)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome，PRRS)由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome?virus．PRRSV)感染引起，主要特征為懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎等嚴(yán)重的繁殖障礙以及仔豬與育肥豬的呼吸道疾病。PRRS是上世紀(jì)80年代后期暴發(fā)的一種新的傳染性疾病，于1987年首發(fā)于北美地區(qū)，在隨后的幾年內(nèi)，便迅速地在歐、美大陸的許多國家流行，隨后又蔓延至亞洲的一些國家，成世界范圍內(nèi)的大流行，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國自1995年底暴發(fā)此病，并迅速傳播至全國各地，成為我國規(guī)模化養(yǎng)豬場引發(fā)繁殖障礙的主要疫病之一。近年來PRRS呈持續(xù)性感染，并導(dǎo)致繼發(fā)性感染增加，嚴(yán)重威脅了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。

PRRS傳播非常迅速，豬群一旦感染即呈持續(xù)性，污染豬場可成為疫源地。雖然PRRSV流行毒株有美洲型和歐洲型，但至今為止，我國分離到的PRRSV流行毒株均為美洲型。由于PRRS與其它許多引起豬繁殖障礙綜合征的疾病(如豬細(xì)小病毒病、豬偽狂犬病、豬瘟等)的臨床癥狀相似，不具有特征性，加上RRRSV感染豬群易引起繼發(fā)感染，發(fā)生細(xì)菌性或病毒性繼發(fā)感染，更使得臨床表現(xiàn)和病理變化復(fù)雜化，豬只個(gè)體之間的臨床表現(xiàn)差異很大，而且近年來越來越多的PRRS是亞臨床型和慢性型病例。僅根據(jù)臨床癥狀和病變及流行病學(xué)特點(diǎn)很難做出診斷，因此PRRS的確診需要借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，特別是新發(fā)生本病的地區(qū)和豬場。

目前國內(nèi)外建立了一系列PRRS診斷方法。其中用于PRRSV檢測方法主要有病毒分離、免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)、血清中和試驗(yàn)(SN)、間接熒光抗體試驗(yàn)(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)、膠體金技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT—PCR)、套式RT-PCR、實(shí)時(shí)RT-PCR和核酸探針原位雜交技術(shù)(ISH)。上述檢測PRRSV抗體的技術(shù)人多針對結(jié)構(gòu)蛋白，而有關(guān)PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的檢測方法還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

??本發(fā)明的目的在于提供一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒，其利用固相酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）原理，以PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp9為診斷抗原，結(jié)合單抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG及其他配套試劑組成。其反應(yīng)機(jī)理為包被抗原和樣品中抗PRRSV?Nsp9抗體結(jié)合導(dǎo)致單抗和抗原的結(jié)合量減少，通過酶標(biāo)抗體形成“包被抗原+結(jié)合單抗+酶標(biāo)抗體”復(fù)合物，加入顯色劑，通過酶催化反應(yīng)顯色。顯色深淺與樣品中的檢測抗體含量成反比，當(dāng)顯色（OD₄₉₀）超過設(shè)定的臨界值時(shí)結(jié)果判為陽性，表明有活毒存在。判定結(jié)果是這樣設(shè)定的：抑制率PI=(OD_未抑制-OD_樣品)?/OD_未抑制*100%，PI>30%對應(yīng)的樣品為陽性，小于則為陰性。具有簡單、快速、敏感和特異性好等特點(diǎn)；適用于區(qū)分臨床區(qū)分豬繁殖與呼吸綜合征病毒活毒和滅活毒抗體。

????本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒，其特征在于：將96孔ELISA板、樣品稀釋液、20倍濃縮洗滌液、羊抗小鼠IgG-HRP結(jié)合物、結(jié)合單抗、終止液、底物A、底物B、陽性樣品、陰性樣品、蓋板膜（11）分別用的廣口瓶加以封裝，貼上標(biāo)簽，組裝成試劑盒，具體組裝方法按以下步驟完成：

???第一步：首先對96孔ELISA板進(jìn)行包被：96空ELISA板上包被有PRRSV?Nsp9蛋白，用包被緩沖液將Nsp9蛋白稀釋到1.5ug/mL，每孔100ul包被ELISA板，37℃包被1h后用含5%脫脂奶粉的PBS?37℃封閉1h，然后用PBS洗滌5次干燥后用鋁箔真空密封備用；