[發明專利]檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒

無效

• 申請號: 201110212152.4
• 申請日: 2011-07-27
• 公開（公告）號: CN102305859A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發明（設計）人: 丁壯;黃志強;母連志;吳娟;楊閩楠;張泉鵬
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 王薇

1.檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒，其特征在于：將96孔ELISA板、樣品稀釋液、20倍濃縮洗滌液、羊抗小鼠IgG-HRP結合物、結合單抗、終止液、A底物、B底物、陽性樣品、陰性樣品、蓋板膜分別用的廣口瓶加以封裝，貼上標簽，組裝成試劑盒，具體組裝方法按以下步驟完成：

???第一步：首先對96孔ELISA板進行包被：96空ELISA板上包被有PRRSV?Nsp9蛋白，用包被緩沖液將Nsp9蛋白稀釋到1.5ug/mL，每孔100ul包被ELISA板，37℃包被1h后用含5%脫脂奶粉的PBS?37℃封閉1h，然后用PBS洗滌5次干燥后用鋁箔真空密封備用；

???第二步：配制樣品稀釋液（PBST?PH7.4）:NaCl?8.0g；KH2PO4?0.2g；Na2HPO4?·12H2O?2.9g；KCl?0.2g補加二餾水致1000ml;加入0.5ml?Tween-20，最后50ml分裝；

???第三步：配制20倍濃縮洗滌液：NaCl?160.0g；KH2PO4?4g；Na2HPO4?·12H2O?58g；KCl?4g補加二餾水致1000ml;加入10ml?Tween-20，最后50ml分裝；

???第四步：將購買的羊抗小鼠IgG-HRP結合物用?10ml?PBST加入2ul羊抗小鼠IgG-HRP二抗進行稀釋，然后加入4%PEG,以25ml分裝；

第五步：結合單抗的制備：

首先根據豬繁殖與呼吸綜合征病毒BJ-4株及變異毒株（HB-1、SY0608、HN-HW、HuN4等）的核苷酸序列，利用Primer軟件設計合成針對PRRSV?Nsp9基因保守區域的特異性引物；用RT-PCR方法擴增出豬繁殖與呼吸綜合征病毒JL/07/SW株Nsp9基因片段，克隆到?pMD18-?T載體并測序，基因克隆至表達載體pET-28a(+)，得到重組表達載體pET-28a-Nsp9?，用經鑒定的陽性重組質粒pET-28a-Nsp9轉化BL21(DE3)?感受態細胞，涂板挑菌(Kan100?mg/mL)，陽性菌在涂加卡那霉素(100?mg/mL)LB液體培養基(Kan?100?mg/mL)中振搖培養過夜后，按1%轉接種于含卡那霉素的LB培養基(Kan100?mg/mL)，37℃振搖培養至對數生長期(OD600nm=0.6)，加入IPTG(終濃度1mmol/L)，37℃誘導培養3?h；離心沉淀菌體,超聲破碎后經電洗脫得到高純度的重組Nsp9蛋白，于-80℃保存備用；

然后用重組Nsp9蛋白制備單克隆抗體，具體方法如下：

1、動物免疫??選擇6-8周齡健康Balb/C小鼠以弗氏完全佐劑乳化純化的PRRSV?Nsp9蛋白,每只小鼠腹腔注射100μg,14d后以弗氏不完全佐劑乳化蛋白腹腔注射100μg,最后一次加強免疫時,直接腹腔注射100μg純化的蛋白,融合前3～4d尾靜脈注射50μg?純化的蛋白；

2、細胞融合??取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0混合于融合管內,?以300g離心10?min,?棄去上清,?振蕩細胞,?使兩種細胞盡量混合均勻,?然后60s內緩慢滴加預熱的PEG-4000溶液,再緩慢加入無血清的1640培養基終止融合,?靜置后再以1?000?r/min離心10?min?,?棄去上清后加入HAT培養基,使細胞懸浮并混勻,?于96孔培養板中培養,第14d開始換液并開始檢測篩選；

3、雜交瘤細胞的篩選和克隆化???克隆的篩選采用間接ELISA,?用純化的PRRSV?Nsp9蛋白作為包被抗原；對所獲陽性雜交瘤細胞的培養上清進行篩選；將ELISA篩選的陽性雜交瘤細胞進行克隆化,將檢出的陽性孔再次克隆和亞克隆,直到所有的孔都為陽性；通過三次細胞克隆最終獲得雜交瘤細胞株2D6；

4、腹水的制備　0.5?mL的高壓滅菌的石蠟油注射到小鼠腹腔,7d后注入106?個雜交瘤細胞于小鼠腹腔,一周后抽取腹水,將收集好的腹水置37℃?24h?,隨后置4℃過夜,?第二天將腹水離心,?上清56℃滅活30?min即可；

5、單克隆抗體的純化　用4倍體積醋酸緩沖液稀釋腹水,調至pH4.5?,緩慢滴加3.3?%的正辛酸,攪拌30?min?,離心取上清,加入1/10體積的10倍PBS?,調至pH7.4?,4℃預冷后,用45?%飽和硫酸銨沉淀,離心后取沉淀,用PBS稀釋后移入透析袋,在50倍體積PBS中透析,透析期間多次換液,透析結束后,紫外分光光度計280?nm?測定蛋白濃度并分裝凍存；

6?抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9蛋白單克隆抗體的特性鑒定　

（1）、腹水效價測定??間接ELISA方法測定,細胞培養上清與腹水分別從10倍和100倍開始做梯度稀釋,同時分別以SP2/0?細胞培養上清和腹水做同等稀釋度作為對照；通過檢測得知2D6單抗的腹水效價為6.4×10⁵；

（2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9蛋白單克隆抗體IgG亞類鑒定??按小鼠mAb?IgG亞類檢測試劑盒的說明書進行；具體方法是將純化的每株單克隆抗體1000倍稀釋后包被酶標板,每孔100μL?,37℃孵育1?h?,洗滌后每孔加入1?000倍稀釋的抗體亞類試劑100μL?,37℃孵育1?h?,洗滌3遍；然后加入羊抗小鼠IgG酶標二抗,?37℃孵育1?h?,洗滌后加入底物顯色,確定單克隆抗體的亞類為IgG2a.

（3）、雜交瘤細胞株染色體的分析??采用秋水仙素法對雜交瘤細胞株進行染色體分析，結果顯示2D6雜交瘤細胞的染色體數目為101條；

（4）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體特異性鑒定??將所獲單克隆抗體分別與豬偽狂犬病毒、豬流感病毒、豬細小病毒進行間接ELISA,檢測所得知制備的單克隆抗體與其它豬病毒病均無交叉反應性；

將以上純化單抗2D6?以80000倍稀釋于PBS中加入4%PEG，25ml分裝；

第六步：配制終止液：2mol/L?H2SO4??濃硫酸44.5ml，雙蒸水355.5ml，10ml分裝；

第七步：配制A底物：TMB?200mg，無水乙醇100ml,加雙蒸水至1000ml，10ml分裝；

第八步：配制B底物：（0.1ml/L檸檬酸-0.2ml/L磷酸氫二納，pH5.0-5.4）:Na2HPO4?14.60g，檸檬酸9.33g，0.75%過氧化氫6.4ml，加三蒸水至1000ml，調至pH5.0-5.43，10ml分裝；

第九步：配制陽性樣品：將標準PRRSV陽性血清1:5稀釋于樣品稀釋液中，1ml分裝；

第十步：配制陰性樣品：將經檢測PRRSV陰性血清1:5稀釋于樣品稀釋液中，1ml分裝。

2.根據權利要求1所述的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的活毒抗體試劑盒，其特征在于所述采用試劑盒進行的檢測方法如下：將待檢血清用樣品稀釋液2倍稀釋后100ul加入ELISA板中37℃孵育1h，設置陽性對照、陰性對照和空白對照；用洗滌液清洗5次，每次2min；然后加入結合單抗每孔100ul，37℃孵育1h，洗滌液清洗5次，每次2min；然后加入羊抗小鼠IgG-HRP結合物37℃作用1h，洗滌液清洗5次，每次2min；然后加入顯色底物溶液，將底物A和底物B以1:1混合，100ul加入ELISA孔中，避光顯色15min，加入50ul終止液，測其OD490值；判定結果是這樣設定的：抑制率PI=(OD未抑制-OD樣品)?/OD未抑制*100%，PI>30%對應的樣品為陽性，小于則為陰性。