[發(fā)明專利]一種甘薯病毒病血清檢測取樣方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110210962.6
• 申請日: 2011-07-20
• 公開（公告）號: CN102305727A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發(fā)明（設計）人: 謝逸萍;孫厚俊;王欣;趙永強;邢繼英;陳曉宇
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇徐州甘薯研究中心
• 主分類號: G01N1/10
• 分類號: G01N1/10;G01N1/28
• 代理公司: 徐州市三聯(lián)專利事務所 32220
• 代理人: 何君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種農(nóng)作物病毒病血清檢測，具體說是涉及一種甘薯病毒病血清檢測取樣方法，屬農(nóng)業(yè)植保技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

甘薯病毒病是甘薯生產(chǎn)中的主要病害之一，廣泛存在于種薯種苗中，嚴重影響了甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。有資料顯示，甘薯病毒病的田間品種發(fā)病率100％，東非、南美由于病毒病造成甘薯大幅度減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。美國、日本也相繼報道了甘薯病毒病造成甘薯產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降，甘薯病毒病是中國甘薯產(chǎn)區(qū)的重要病害，是造成甘薯退化減產(chǎn)的重要原因。病毒病的感染可使產(chǎn)量降低30％～50％，病毒病的防治方法主要是對品種進行脫毒培養(yǎng)，脫除病毒后的甘薯能夠大幅度提高產(chǎn)量和質(zhì)量，一般品種脫毒后增產(chǎn)20％以上，高者達200％之多，且品種間有較大差異。甘薯脫毒種薯在生產(chǎn)上利用，可有效地防治病毒病的發(fā)生，但脫毒種薯的質(zhì)量是保證防治措施實施的重要環(huán)節(jié)，因此，有效、快速地鑒定品種的帶毒率，是保證脫毒種薯質(zhì)量的關(guān)鍵。血清學檢測是甘薯病毒病檢測的重要手段，而以往檢測的樣品是以甘薯的葉片為主，在2002年謝逸萍對此進行了部分改進，以葉柄為檢測的樣品，為此，病毒檢出率提高了20％，2010年，謝逸萍等人又根據(jù)不同甘薯病毒在甘薯體內(nèi)存在的部位，對血清學檢測的取樣方法進行了再次改進，從而提高了甘薯脫毒種薯的檢測效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種甘薯病毒病血清檢測取樣方法。根據(jù)國際甘薯病毒病的研究報道，不同甘薯病毒在甘薯中存在的部位不同，有的病毒在甘薯葉肉中含量較高，有的病毒在甘薯的葉柄中含量較高，該方法通過對甘薯葉片、葉柄和葉片與葉柄結(jié)合部的甘薯病毒檢出率比較試驗，從CI部提取液進行對應檢測，記錄顯色結(jié)果，陽性表示含有病毒。

本發(fā)明是以如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種甘薯病毒病血清檢測取樣方法，其特征是：按如下步驟進行：

(1)參試樣品準備：從田間取回待檢測的脫毒甘薯樣品(取葉片加葉柄)；

(2)取樣：對塑料袋進行編號，用直徑15mm試管取葉片和葉柄的結(jié)合部，需隔在塑料袋外取，只留葉片和葉柄的結(jié)合部，其余除去；

(3)檢測樣品的制備：加1ml提取緩沖液，用玻璃試管在塑料袋外碾磨，室溫放置20-30分鐘，使植物汁液充分提取；

(4)點樣：a、將一張干燥的濾紙放在實驗臺上，將膜放在上面，避免氣泡產(chǎn)生；b、用一個無菌的槍頭吸塑料袋中提取液上清部分(15-20微升)，點在膜上方格正中，不要用槍頭碰到膜，一個樣品用一個槍頭，點樣過程中一直戴手套和用鑷子接觸膜，手指印可能造成假陽性結(jié)果；

(5)設陽性對照：在每張膜的最后設置陽性對照，點樣完成將膜轉(zhuǎn)到一張干燥的濾紙上，干燥15-20分鐘，在繼續(xù)實驗前可以用兩張濾紙夾著膜保存；

(6)血清學檢測：血清學檢測根據(jù)酶聯(lián)包中的步驟進行：封閉液孵育60分鐘→TBS快速洗膜→加入病毒抗體液50rpm孵育過夜→倒掉病毒抗體液加入T-TBS100rpm洗膜3次→加入酶標抗液體50rpm孵育1小時→除去酶標抗液體，用30mlT-TBS洗膜4次→將膜放入裝有染色液的培養(yǎng)皿中，50rpm孵育30分鐘→用蒸餾水100rpm洗膜3次，終止顯色→濾紙吸干水分，記錄顯色結(jié)果，陽性的表示含有病毒。

本發(fā)明的優(yōu)點是：以葉片與葉柄結(jié)合部提取液做為樣本進行病毒血清學檢測，提高了病毒陽性檢出率，利用葉柄汁液中病毒濃度高、雜質(zhì)少，及葉柄葉肉兼顧，有效地消除了葉片和葉柄取樣的局限性，因為不同甘薯病毒在葉片上存在的部位不同，病毒主要通過維管束傳播，大部分病毒可在維管束中增殖，葉柄中含有大量維管束，而有少數(shù)甘薯病毒主要是在葉肉中繁殖和存在，單用葉柄檢測則無法檢測到所有病毒，以葉片與葉柄結(jié)合部提取液作為檢測樣品可消除取樣上的誤差。同時葉片與葉柄結(jié)合部提取液比較清淡，避免了葉綠素的沉積影響。提高脫毒種薯病毒病檢出率，對于全面了解生產(chǎn)中脫毒種薯的帶毒率、指導脫毒薯的開發(fā)利用具有重要意義和現(xiàn)實作用。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明：

實施例、

甘薯病毒病血清檢測取樣新方法，我們對葉、葉柄、葉片和葉柄結(jié)合部進行檢出率比較試驗，按如下步驟進行：

(1)參試樣品準備：從田間取回徐薯18和北京553的樣品，每品種取15個；

(2)檢測樣品的制備：對塑料袋進行編號，每個樣分別取葉片、葉柄、葉片和葉柄和結(jié)合部進行對應檢測，每一塑料袋中加1ml提取緩沖液，用玻璃試管在塑料袋外碾磨，室溫放置20-30分鐘，使植物汁液充分提取；