[發(fā)明專利]一種造礁石珊瑚卵母細(xì)胞石蠟切片的制作方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110210581.8
• 申請(qǐng)日: 2011-10-09
• 公開（公告）號(hào): CN102313660A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尤豐;黃暉;李元超;練健生;楊劍輝;周國偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院南海海洋研究所
• 主分類號(hào): G01N1/28
• 分類號(hào): G01N1/28;G01N1/30;G01N1/36
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明涉及石蠟切片的制作技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種造礁石珊瑚卵母細(xì)胞石蠟切片的制作方法。

背景技術(shù)

????珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)是地球上生產(chǎn)力最高的生態(tài)系統(tǒng)之一，為四分之一的海洋生物提供了棲息場(chǎng)所，在海洋生態(tài)系統(tǒng)中不可替代。由于全球氣候變化，海洋污染加劇，過渡的海洋漁業(yè)破壞及敵害生物的大規(guī)模爆發(fā)，世界范圍內(nèi)珊瑚礁發(fā)生迅速退化，世界珊瑚礁面積急劇較少。因此，在珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的研究中，珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的重建和人工修復(fù)是該生態(tài)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

造礁石珊瑚作為形成珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的主要造礁生物和三維結(jié)構(gòu)構(gòu)建者，造礁石珊瑚的增殖在珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)重建和修復(fù)過程中扮演著極為重要的角色。造礁石珊瑚增殖方式有性繁殖和無性繁殖，造礁石珊瑚的有性繁殖方式為主要繁殖方式。造礁石珊瑚的有性繁殖主要方式為排放精卵進(jìn)行體外受精，但是造礁珊瑚排卵周期長(zhǎng)（1年左右），排放精卵時(shí)間短（1周以內(nèi)），并在不同海域排卵時(shí)間存在明顯差異。因此，預(yù)測(cè)造礁珊瑚排卵時(shí)間是珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)重建和人工修復(fù)的重要基礎(chǔ)性工作。準(zhǔn)確了解造礁珊瑚卵母細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)，是進(jìn)行保護(hù)和恢復(fù)珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的重要科學(xué)依據(jù)。

國際常規(guī)監(jiān)測(cè)造礁石珊瑚卵母細(xì)胞發(fā)育程度方法是水下取造礁石珊瑚斷枝，依據(jù)其斷面卵母細(xì)胞發(fā)育的顏色和大小判斷卵母細(xì)胞發(fā)育的程度，從而推斷其排卵時(shí)間。該方法在浪大流急等海況時(shí)整個(gè)水下操作過程會(huì)十分困難。水下操作者的經(jīng)驗(yàn)不同，在進(jìn)行造礁石珊瑚卵母細(xì)胞發(fā)育程度判斷時(shí)會(huì)存在各種差異，最終造成預(yù)測(cè)造礁石珊瑚排卵時(shí)間的不準(zhǔn)確。同時(shí)也易由于水下亮度和海水折射等不確定因素影響水下操作者對(duì)造礁石珊瑚卵母細(xì)胞顏色的判斷，最終影響對(duì)造礁石珊瑚排卵時(shí)間的預(yù)測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

????本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，提供一種利用石蠟切片技術(shù)研究造礁石珊瑚卵母細(xì)胞發(fā)育過程并檢測(cè)造礁石珊瑚卵母細(xì)胞發(fā)育程度的方法。

????本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

????一種造礁石珊瑚卵母細(xì)胞石蠟切片的制作方法，包括如下步驟：（1）在海底采集含有造礁石珊瑚卵母細(xì)胞的健康珊瑚；（2）固定；（3）脫去造礁石珊瑚的鈣質(zhì)骨骼；（4）脫去組織中的水分；（5）將組織透明化；（6）將石蠟浸入組織為切片做準(zhǔn)備；（7）切片并修正；（8）將切片固定在載玻片上；（9）脫去切片上的石蠟；（10）染色；（11）脫水、封片。

????作為一種優(yōu)選方案，步驟（1）中所述造礁石珊瑚為直徑大于20cm的珊瑚塊，健康程度較好，且無發(fā)白變色現(xiàn)象。

????作為一種優(yōu)選方案，步驟（2）中所述固定是用濃度為3.5~4.5%的海水甲醛固定。

????作為一種優(yōu)選方案，步驟（3）中所述脫去造礁石珊瑚的鈣質(zhì)骨骼是將固定完成的造礁石珊瑚樣品用純水沖洗數(shù)次，然后用45~55%的甲酸溶液脫鈣，脫鈣時(shí)間為24~48h。

????作為一種優(yōu)選方案，步驟（4）中所述脫去組織中的水分是用乙醇按照從低濃度到高濃度的順序進(jìn)行脫水，依次為50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇和無水乙醇，每次1~2h。使用乙醇是因?yàn)橐掖技饶芘c水相混合，又能與有機(jī)溶劑相溶；用梯度酒精脫水時(shí)為了減少生物組織的急劇收縮的問題。如果不能一次性完成整個(gè)脫水步驟，可以將樣品暫時(shí)保存在70%的乙醇中。

????作為一種優(yōu)選方案，由于無水乙醇不能與石蠟相溶，所以需要能與乙醇和石蠟相溶的媒浸液置換出生物組織中的乙醇，使組織透明，所以步驟（5）中將組織透明化是將組織在1:1的乙醇和二甲苯預(yù)混液中浸漬1~2h，再將組織放入100%二甲苯中浸漬25~35min。

????作為一種優(yōu)選方案，步驟（6）用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用。通常先把組織材料塊放在熔化的石蠟（溶點(diǎn)：54℃）和二甲苯的等量混合液浸漬1~2h，再先后移入2個(gè)熔化的石蠟液中浸漬3h左右，浸蠟應(yīng)在高于石蠟熔點(diǎn)57~60℃左右的溫箱中進(jìn)行，以利石蠟浸入組織內(nèi)。浸蠟后的組織材料塊放在裝有蠟液的容器中（擺好在蠟中的位置），待蠟液表層凝固即迅速放入冷水中冷卻，即做成含有組織塊的蠟塊。容器可用光亮且厚的紙折疊成紙盒或金屬包埋框盒。如果包埋的組織塊數(shù)量多，應(yīng)進(jìn)行編號(hào)，以免差錯(cuò)。石蠟熔化后應(yīng)在蠟箱內(nèi)過濾后使用，以免因含雜質(zhì)而影響切片質(zhì)量，且可能損傷切片刀。