[發(fā)明專利]黑水纈草不定根培養(yǎng)生產(chǎn)纈草素的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110208935.5
• 申請日: 2011-07-25
• 公開（公告）號: CN102293157A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王振宇;崔磊;周秀華;趙海田
• 申請（專利權(quán)）人: 哈爾濱工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C07D311/94
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 韓末洙

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)纈草素的方法。

背景技術(shù)

黑水纈草(V.amurensis?Smir.ex?Kom.)為敗醬科(Valerianaceae)纈草屬(Valeriana?L)野生多年生草本植物。纈草具有廣泛的藥理活性及悠久的用藥歷史，其性平味辛，具有鎮(zhèn)靜安神，解攣止痛的功效，其根莖長期以來一直作為鎮(zhèn)靜藥用于民間，早在明代《本草綱目》中就有記載。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前全世界有25個(gè)國家的81種纈草得到程度不同的研究。日本的北海纈草(V.officinalis?var?latifolia)，印度纈草(V.wallichii?DC)和墨西哥纈草(V.edulis?Meyer)目前仍是藥用的商業(yè)來源。而目前我國對于纈草資源的開發(fā)尚處于起步階段，僅有少量研究報(bào)道。

在我國，纈草素主要從黑水纈草中獲得。然而目前對于黑水纈草的獲取主要還是依賴于野生纈草資源，由于多年來的過度采挖，其賴以生存的森林生態(tài)環(huán)境遭受到嚴(yán)重的破壞。然而人工栽培很難模擬出野生環(huán)境，其培養(yǎng)出的纈草的生長和代謝產(chǎn)物含量無法與野生植株比擬。此外人工栽培大田栽培生產(chǎn)周期長，占地面積大，且生產(chǎn)的植株和產(chǎn)物的品質(zhì)易受到氣候、栽培條件及病蟲害的影響，供應(yīng)難以滿足市場的需求。研究非土地培植的纈草培養(yǎng)方法稱為當(dāng)務(wù)之急。目前利用生物技術(shù)進(jìn)行中藥資源繁殖并大規(guī)模生產(chǎn)其有效成分已成為一條新的發(fā)展途徑，但藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)的弊端之一是有效成分的含量不穩(wěn)定，這主要是由于大多數(shù)有效成分均為次生代謝產(chǎn)物，其合成在細(xì)胞階段表現(xiàn)不強(qiáng)造成的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是要解決目前人工栽培的黑水纈草中纈草素含量低，植物細(xì)胞培養(yǎng)方法中纈草素含量不穩(wěn)定的問題，提供黑水纈草不定根培養(yǎng)生產(chǎn)纈草素的方法。

本發(fā)明黑水纈草不定根培養(yǎng)生產(chǎn)纈草素的方法，按以下步驟進(jìn)行：一、黑水纈草無菌苗的培養(yǎng)：將黑水纈草種子于-4℃冷凍7天，然后對種子進(jìn)行除菌處理，之后置于不含激素的1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，得到幼苗，將幼苗移植到不含激素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在16h光照條件下培養(yǎng)20～40天，得到黑水纈草無菌苗；二、取黑水纈草無菌苗的葉片置于固體培養(yǎng)基上，在無菌、24～26℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，4周后誘導(dǎo)出不定根，將不定根置于固體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，每4周繼代培養(yǎng)一次；三、將步驟二誘導(dǎo)出的不定根接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，在無菌、24～26℃、55～65r/min搖床轉(zhuǎn)速下進(jìn)行暗培養(yǎng)，4周后得到不定根，將得到的不定根置于液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，每4周繼代培養(yǎng)一次；四、將步驟三繼代培養(yǎng)得到的不定根經(jīng)過冷凍干燥后，研磨成粉末，用二氯甲烷在25～30℃超聲浸提粉末30min，離心后收集上清液，然后再重復(fù)超聲浸提沉淀2次，離心后收集上清液，合并上清液，得提取液，對提取液進(jìn)行真空過濾，干燥后得到提取物，即完成黑水纈草不定根培養(yǎng)生產(chǎn)纈草素；其中步驟二所述固體培養(yǎng)基為含有1mg/L?2，4-D、0.2mg/L?KT和6g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基，步驟三所述液體培養(yǎng)基為含有0.2mg/L?IBA和0.2mg/L?KT的MS培養(yǎng)基。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明利用組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)黑水纈草不定根，比培養(yǎng)黑水纈草細(xì)胞更具有實(shí)際意義，其生長速率比原根快很多。

本發(fā)明方法得到的不定根與目前人工栽培的黑水纈草相比，生產(chǎn)的纈草素具有穩(wěn)定的質(zhì)量和產(chǎn)量，不受自然條件的限制和影響。通過人工調(diào)節(jié)與控制不定根的生長和次生產(chǎn)物的合成，可極大的提高纈草素的產(chǎn)量。纈草素占不定根組織干重的含量為4.8～5.06mg/g，本發(fā)明得到的提取物中含有質(zhì)量百分比為80％～85％的纈草素。

本發(fā)明的方法不占用耕地面積，只需要占用有限的廠房和培養(yǎng)室；不使用光照，不定根在暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行，故可節(jié)省電力，減少成本，污染率極低。

附圖說明

圖1為具體實(shí)施方式十二中種子破除休眠后萌發(fā)得到的幼苗；圖2為具體實(shí)施方式十二的步驟二中誘導(dǎo)出的不定根在固體培養(yǎng)基中繼代3次后的生長狀態(tài)圖；圖3為具體實(shí)施方式十二的步驟三中不定根在液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)4周后的生長狀態(tài)；圖4為纈草素標(biāo)樣的HPLC色譜圖；圖5為具體實(shí)施方式十二得到的提取物的HPLC色譜圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。