[發明專利]一種rhIL-12工程細胞大規模無血清培養方法

有效

• 申請號: 201110208009.8
• 申請日: 2011-07-20
• 公開（公告）號: CN102268407A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發明（設計）人: 田志剛;程民;魏海明;鄭曉東;孫汭;費保珍
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王旭

技術領域

本發明屬生物技術領域，涉及細胞培養基和培養方法。具體而言，本發明為一種利用無血清無蛋白培養基對重組人白細胞介素-12工程細胞進行大規模培養的方法，利用該方法培養重組人白細胞介素-12工程細胞，可獲得高產量、高活性的重組人白細胞介素-12。

背景技術

人白細胞介素-12(Human?Interleukin?12，hIL-12)是一種異二聚體細胞因子，由p35和p40兩個亞單位通過多對二硫鍵連接組成。hIL-12又稱為NK細胞刺激因子(NKSF)，具有強烈的抗腫瘤和抗病毒效益，這種效應是由機體的自然殺傷細胞(Natural?killer?cells，NK細胞)介導的，hIL-12還在細胞毒性T細胞、輔助性T細胞、B細胞的發育分化和成熟活化中起重要作用，被譽為免疫系統行使抗病毒、抗腫瘤的核心調控因子，機體天然免疫系統的關鍵蛋白質。這一系列的生物學功能使人們認識到hIL-12有可能在臨床應用中發揮重要作用。目前，重組人白細胞介素-12(Recombinant?Human?Interleukin?12，rhIL-12)作為一種藥物已經進入抗腫瘤、抗病毒性疾病和過敏性哮喘的臨床試驗階段，但其規模化生產仍存在一定的困難。因此，通過體外培養獲得高產量、高活性的rhIL-12已成為亟需解決的問題。由于IL-12結構的復雜性，使其無法在E.coli中獲得表達，必須采用真核表達體系來獲取重組蛋白。IL-12(p70)分子是由p40和p35兩個不同的亞基組成的異二聚體分子，p40和p35兩個亞基分別由兩個染色體上兩個不同的基因編碼，只有在同一細胞內同時產生才能得到有生物學活性的二聚體。p40和p35兩個亞基的天然表達嚴重不平衡，胞漿中p40的生成大于p35，分泌的p40易于形成二聚體，對IL-12的活性有抑制作用。由于兩條鏈在胞內的不平衡表達，從而很難獲取高表達rhIL-12的工程細胞株。此外，rhIL-12在制備過程中極易失活，導致回收率極低，從而限制了產量。目前，用于真核表達的細胞主要有酵母細胞、COS細胞、昆蟲細胞、CHO細胞。前三者因較難直接分泌重組蛋白或不能持續表達蛋白產物或培養成本較高，實際應用中難以獲得大量產品。CHO細胞表達體系，避免了上述體系的不足，外源蛋白易于分泌到培養基中，能正確組裝多亞基蛋白，外源基因整合穩定，能完成翻譯后修飾，能以懸浮培養或在無血清培養基中達到高密度，培養規模易于放大，已成為表達外源基因的最佳宿主之一。因此，CHO細胞成為rhIL-12生產的首選載體。綜合上述原因，經過幾年的努力，我們成功建立了高效表達rhIL-12蛋白的重組CHO細胞(rhIL-12工程細胞)，獲得了國家發明專利(中國專利號：zl.03131567.4)，為rhIL-12工程細胞大規模培養方法的建立奠定了基礎。

無血清培養基為不含人或動物血清的培養基，但可能包含個別蛋白或大量蛋白組分，主要用于一些需要在無血清條件下生長的特殊類型的細胞及用于蛋白質生產的工程細胞的培養。無血清培養基是工程細胞培養的重要工具，使細胞培養在一套限定的條件下進行，避免了血清中復雜成分對后續研究及臨床使用的干擾及影響。使用無血清培養基對工程細胞進行培養具有以下優點：(1).增加產物的確定性；(2).產物性能更加一致；(3).容易進行純化和下游加工；(4).細胞功能的精確評估；(5).增強生長和/或產量；(6).生理反應性的較好對照；(7).增強細胞內中介物的檢測。重組細胞的培養是基因工程藥物研究與開發的主要環節之一。研究人員一直致力于建立易于操作、產量高、產物活性高、成本低的工程細胞大規模培養的方法，其中生物反應器在大規模培養中占重要地位。生物反應器按細胞培養方式不同可分為三類：懸浮培養用生物反應器、貼壁培養用生物反應器、包埋培養用生物反應器。懸浮培養用生物反應器不需要使用微載體，細胞在反應器中不貼壁，懸浮于細胞培養液中生長，如攪拌反應器、中空纖維反應器、氣升式反應器等。貼壁培養用生物反應器需要使用微載體，微載體懸浮于反應器的細胞培養液中，細胞貼附在微載體上生長，如攪拌反應器(微載體培養)、中空纖維反應器等。包埋培養用生物反應器使用多孔載體或微囊，細胞被截留在載體中或包埋于微囊中，如流化床反應器、固化床反應器。美國NBS(New?Brunswick?Scientific?Co.，inc)公司產生的生物反應器就是一種包埋培養用生物反應器，其優點在于能最大程度降低攪拌剪切力對細胞的傷害，細胞容易培養生長，既可以用于貼壁細胞培養，又可用于懸浮細胞培養。