[發明專利]一種將抗逆基因導入轉基因741楊的方法

無效

• 申請號: 201110207267.4
• 申請日: 2011-07-22
• 公開（公告）號: CN102329818A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 金華;姜國斌;郭鵬;朱學靜;王穎
• 申請（專利權）人: 大連民族學院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種農桿菌介導的將抗逆基因AtNDPK2導入轉雙抗蟲基因741楊的方法。

背景技術

隨著植物轉基因技術的日益成熟，越來越多的轉基因植物研制成功并逐漸進入市場，我國在林木轉基因方面也取得了一定的進展。轉雙抗蟲基因741毛白楊(以下簡稱轉基因741楊)是河北農業大學林學院生物技術實驗室和中科院合作，運用農桿菌介導法將Bt殺蟲蛋白BtCry1Ac基因和慈菇蛋白酶抑制基因AHPI雙價抗蟲基因同時轉入優良741毛白楊，獲得的不同系號轉雙抗蟲基因無性系。室內飼蟲試驗已確定出高抗株系(室內試蟲死亡率＞75％)和中抗株系(室內試蟲死亡率40％～75％)^[1]。轉基因741楊的成功研制為害蟲防治提供了一條新的途徑。

在已轉入基因的物種中再轉入具有其他的功能的新基因，目前還沒有研究報道。轉基因741楊由中科院微生物所與河北農業大學合作完成。雙抗蟲基因的導入，使轉基因741楊獲得了高抗楊扇舟蛾和美國白蛾等主要鱗翅目害蟲的能力，大大減少農藥施用量。同時通過室內及試驗地的飼蟲試驗，苗期的生長觀測和形態觀測以及分子生物學檢測等方法，最終獲得了基本不飛絮的敗育雌株轉雙抗蟲基因的優良白楊派雜種，避免了種間的花粉傳播，降低了741楊基因污染的風險。

NDPK2基因主要編碼植物核苷二磷酸激酶2，近年來的研究表明，NDPK2可參與促分裂原蛋白激酶MAPK級聯反應^[2]，進而上調POD、CAT、硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶和過氧化物還原酶等多種抗氧化酶基因的表達，調節細胞的氧化還原狀態^[3]。從擬南芥中克隆出NDPK2基因，命名為AtNDPK2。AtNDPK2的對大麥、馬鈴薯的遺傳轉化研究也表明，AtNDPK2基因的過量表達增強了作物對干旱、鹽漬或極端溫度的忍耐性。AtNDPK2基因對作物的遺傳轉化具有重要的實踐意義。但迄今為止，未見有關此基因在楊樹中遺傳轉化的報道。

隨著環境的不斷惡化，植物不僅要受到病蟲的危害，而且諸多非生物因素，如干旱、鹽堿、低溫也嚴重影響著植物的生長發育和作物產量。楊樹是林業最早開展基因工程研究的樹種^[4-5]，尤其是轉抗逆基因的木本植物在治理鹽堿化、沙漠化土地，改善生態環境及增加林業收入等方面，具有草本植物不可替代的優勢。隨著我國土地荒漠化、鹽漬化和凍害的不斷加劇，病蟲害的不斷增加，利用現代生物技術，快速培育兼有抗蟲和抗逆植物新品系，是實現擴大種植面積，緩解土地矛盾，減少農藥危害的有效途徑之一。

發明內容

本文以已轉入雙抗蟲基因的741毛白楊無菌苗的葉片為材料，建立其再生及轉基因體系，并通過農桿菌介導法將抗逆基因AtNDPK2導入其中，以期獲得即抗蟲且抗非生物脅迫能力強的轉基因楊樹新品系。本發明的技術依據是：

以轉基因741楊的葉片為外植體，在已轉入雙抗蟲基因的基礎上，采用農桿菌介導的轉化方法，將抗逆AtNDPK2基因導入轉基因741楊中，獲得了即抗蟲、又抗逆的轉基因楊樹，通過對轉化條件的優化，建立穩定的遺傳轉化體系。為楊樹抗蟲、抗逆品種的培育奠定基礎，同時還可以為楊樹基因工程操作技術提供參考數據。

本發明涉及到的轉雙抗蟲基因741毛白楊的無菌苗，由河北農業大學林學院提供；

本發明涉及到的根癌農桿菌EHA105，其攜帶的質粒pCAMBIA1300上含有AtNDPK2基因片段；此菌種由韓國生命工學研究院(KRIBB)提供。

MS(Murashige?and?Skoog，1962)培養基，是植物組培的常用培養基，廣泛用于植物的器官、花藥、細胞和原生質體培養，效果良好。本發明所用的植物培養基均以MS為基本培養基，附加了不同的添加劑。

本發明是通過如下步驟實現的：

I制備侵染菌液

挑取農桿菌EHA105的菌落接種到含有潮霉素50mg/L的10～15ml?YEP液體培養基中，于26℃下，200rpm震蕩培養24小時，取10～100μl的菌液轉接至30～50ml的YEP液體培養基中，于26℃下，200rpm震蕩培養，待菌體OD₆₀₀達到0.8～1.0時，離心收集沉淀，用與離心前等體積的MS液體培養基重新懸浮沉淀后，即得侵染菌液；

II轉化

a.預培養：取轉基因741楊無菌苗的葉片，在靠近葉柄1/3處沿垂直主脈的方向剪下，并在葉片一側垂直主脈剪1個傷口，傷口深達主脈，接種在分化培養基上進行預培養2天；