[發明專利]一種將抗逆基因導入轉基因741楊的方法

無效

• 申請號: 201110207267.4
• 申請日: 2011-07-22
• 公開（公告）號: CN102329818A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 金華;姜國斌;郭鵬;朱學靜;王穎
• 申請（專利權）人: 大連民族學院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生

1.一種將抗逆基因導入轉基因741楊的方法，其特征在于，具體步驟為：

I制備侵染菌液

挑取農桿菌EHA105的菌落接種到含有潮霉素50mg/L的10～15ml?YEP液體培養基中，于26℃下，200rpm震蕩培養24小時，取10～100μl的菌液轉接至30～50ml的YEP液體培養基中，于26℃下，200rpm震蕩培養，待菌體OD₆₀₀達到0.8～1.0時，離心收集沉淀，用與離心前等體積的MS液體培養基重新懸浮沉淀后，即得侵染菌液；

II轉化

a.預培養：取轉基因741楊無菌苗的葉片，在靠近葉柄1/3處沿垂直主脈的方向剪下，并在葉片一側垂直主脈剪1個傷口，傷口深達主脈，接種在分化培養基上進行預培養2天；

所述的分化培養基為：MS+6-BA?1.0mg/L+IBA?0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.5g/L；

b.共培養：將步驟IIa所得葉片完全浸沒在步驟I制備的侵染菌液中10～20min，用無菌濾紙吸干葉片后，轉入共培養培養基上，25～27℃進行暗培養3～5天；

所述的共培養培養基為：MS+6-BA?1.0mg/L+IBA?0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.5g/L；

c.篩選培養：用無菌水沖洗共培養后的葉片，然后用無菌濾紙吸干，將葉塊轉移到分化篩選培養基上培養，培養溫度為25～27℃，光照強度為2500lux，光照時間為14小時/天，培養2-3周分化出抗性不定芽；

所述的分化篩選培養基為：MS+6-BA?1.0mg/L+IBA?0.1mg/L+Hyg3mg/L+Cef400mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.5g/L；

d.繼代篩選培養：將步驟c所得抗性不定芽轉到繼代篩選培養基中進行培養20～30天獲得抗性芽，每10天換一次培養基；培養溫度為25～27℃，光照強度為2500lux，光照時間為14小時/天；

所述的繼代篩選培養基為：MS+6-BA?0.5mg/L+IBA?0.05mg/L+Hyg5mg/L+Cef?400mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.5g/L；

e.生根培養：步驟d所得抗性芽長到2～3cm時，切下并插入生根篩選培養基上進行生根培養，培養2-3周，獲得抗性植株；

所述的生根篩選培養基為：1/2MS+IBA?0.05mg/L+Hyg5mg/L+Cef400mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.5g/L；

III鑒定

采用CTAB法提取步驟II所獲的轉化植株的DNA，以PCR法對候選植株DNA進行檢測，所用引物如下：

上游引物：5′-ATTTATCGGCAAGGTGGAGGTT-3′，

下游引物：5′-CCCGGTGAGGTGATTTGAA-3′；

PCR反應條件：94℃1min，54℃1min，72℃2min，35個循環；72℃延伸10min，擴增產物用0.8w％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.根據權利要求1所述的將抗逆基因導入轉基因741楊的方法，其特征在于：步驟IIb中葉片的侵染時間為15min。

3.根據權利要求1所述的將抗逆基因導入轉基因741楊的方法，其特征在于：步驟IIb中共培養時間為3天。

4.根據權利要求1所述的將抗逆基因導入轉基因741楊的方法，其特征在于：步驟IIb中共培養培養基pH為5.2。

5.根據權利要求1所述的將抗逆基因導入轉基因741楊的方法，其特征在于：步驟IIb所述的共培養培養基中加入乙酰丁香酮200μmol/L。