[發(fā)明專利]一種發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法及其培養(yǎng)基組份

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110207208.7
• 申請日: 2011-07-23
• 公開（公告）號: CN102268466A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙志全;劉茂田
• 申請（專利權(quán)）人: 魯南新時代生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12P17/02
• 分類號: C12P17/02;C12R1/465
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體為一種發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法及其培養(yǎng)基組份。

背景技術(shù)

本發(fā)明涉及的發(fā)酵法生產(chǎn)的利普司他汀是新型減肥藥奧利司他的中間體。奧利司他目前是全球唯一的減肥類藥品，是長效和強(qiáng)效的特異性胃腸道脂肪酶抑制劑，它通過與胃和小腸腔內(nèi)胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性絲氨酸部位形成共價鍵使酶失活而發(fā)揮治療作用，失活的酶不能將食物中的脂肪，主要是甘油三酯水解為可吸收的游離脂肪酸和單?；视?。未消化的甘油三酯不能被身體吸收，從而減少熱量攝入，控制體重。

奧利司他的生產(chǎn)有兩種方法，發(fā)酵合成法以及全合成法。全合成法生產(chǎn)成本比較高。發(fā)酵合成法生產(chǎn)成本比較低，更適合大規(guī)模生產(chǎn)。

美國專利US4598089、US2005089978A1涉及到的利普司他汀發(fā)酵工藝不采用流加補(bǔ)料以及中間補(bǔ)料的方法，發(fā)酵水平比較低。

歐洲專利EP0S03576A2以及國際專利WO2007134836A1、WO?2007078263A2涉及到的發(fā)酵工藝部分采用流加亞油酸和氨基酸的工藝，但是發(fā)酵水平比較低；歐洲專利EP0803576發(fā)酵水平低于1g/L。

國際專利WO2004003212采用了不同的淀粉底物，發(fā)酵水平為1.486g/L；國際專利WO03048335發(fā)酵水平為1.8g/L。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)酵水平低、不穩(wěn)定的問題，本發(fā)明提供了一種新的發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝控制方法和發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分。

本發(fā)明的方法包括毒三素鏈霉菌(Streptomyces?toxytricini)或其衍生物的斜面菌種培養(yǎng)、搖瓶種子液培養(yǎng)、種子液培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)。所述毒三素鏈霉菌(Streptomyces?toxytricini)可以是ACCC?41038。具體工藝過程如下：

a.斜面菌種的制備：將凍干的菌種用無菌水稀釋后涂布裝有固體培養(yǎng)基的斜面上，溫度28℃，濕度40～60％，培養(yǎng)8～10天。產(chǎn)孢后加無菌水制成孢子懸浮液。

b.搖瓶種子液制備：將斜面孢子接種搖瓶種子培養(yǎng)基，250rpm，溫度28℃，培養(yǎng)20～30小時。

c.種子液的制備：將步驟b中培養(yǎng)好的搖瓶種子接種到儲有種子培養(yǎng)基的種子罐中，接種量為種子培養(yǎng)基體積的0.1～0.8％(V/V)，在28℃下通氣量0.8VVM～1.0VVM，單位VVM是體積/體積/分鐘，罐壓0.04～0.07MPa的條件下，培養(yǎng)20～40小時。

d.發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟c中培養(yǎng)好的菌種接種到儲有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種種子液的量占發(fā)酵培養(yǎng)基和種子液體積的5～10％(V/V)，在溫度為28℃，通氣量0.6VVM～1.1VVM，罐壓0.06～0.08MPa，發(fā)酵過程中pH控制在6.5～7.5范圍內(nèi)，發(fā)酵過程中補(bǔ)入營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)160～190小時。

步驟a中所用培養(yǎng)基成分和含量為：葡萄糖2～8g/L，麥芽提取物2～8g/L，酵母提取物4～10g/L，瓊脂10～20g/L，pH為6.9～7.4；步驟b中所用培養(yǎng)基成分和含量為：甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L，pH為6.0～6.5；步驟c中所用液體培養(yǎng)基成分和含量為：甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L，pH為6.0～6.5。步驟d中所用液體培養(yǎng)基成分和含量為：甘油10～20g/L，脫脂豆粉20～40g/L，豆油10～20g/L，消泡劑2～5g/L，發(fā)酵初始pH為6.7～7.0。

在步驟d發(fā)酵過程中，在接種后至30小時左右，即發(fā)酵培養(yǎng)基中的甘油消耗殆盡后，開始流加補(bǔ)料亞油酸和亮氨酸溶液(亮氨酸溶液濃度70g/L，pH為11)，補(bǔ)料流加速度為0.2～0.5g/L/h，單位g/L/h是克/升/小時，在發(fā)酵接種后至115h，補(bǔ)料速度進(jìn)行調(diào)整，補(bǔ)料流加速度為0.2～0.5g/L/h。同時，在發(fā)酵過程中，在接種后至70小時左右，一次性補(bǔ)入滅菌的酵母提取物以及甘油，使培養(yǎng)基中酵母提取物以及甘油基質(zhì)濃度在5～10g/L的水平。

本發(fā)明發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中使用脫脂豆粉為主要氮源，甘油和豆油為主要碳源，發(fā)酵培養(yǎng)基中無須添加無機(jī)鹽。在發(fā)酵表達(dá)利普司他汀階段連續(xù)補(bǔ)料亞油酸和氨基酸的基礎(chǔ)上，在發(fā)酵的特定階段一次性補(bǔ)加一定量的甘油和酵母提取物，避免了現(xiàn)有技術(shù)中的高粘度、溶氧不好控制的情況，提高了發(fā)酵過程中表達(dá)的穩(wěn)定性，提高了發(fā)酵效價，降低了發(fā)酵成本。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明不僅限于以下實施例。