[發明專利]轉基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁側序列及其應用

有效

• 申請號: 201110206849.0
• 申請日: 2011-07-22
• 公開（公告）號: CN102888398A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發明（設計）人: 金蕪軍;宛煜嵩;王文娟;張秀杰;苗朝華
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 張慶敏

技術領域

本發明涉及轉基因植物檢測領域，具體地說，涉及轉基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁側序列，以及根據該旁側序列設計特異性引物PCR檢測轉基因水稻品系Bar68-1。

背景技術

水稻是我國重要的糧食作物之一，隨著轉基因技術在水稻中的研究和應用，已經有多個轉基因水稻品系進入了環境釋放，并申請商業化種植。2009年8月，我國農業部發放了轉基因水稻品系華恢1號和Bt汕優63的生產應用安全證書。對轉基因植物進行品系特異性的檢測是對轉基因植物進行監督管理，保障其健康發展的重要技術基礎。而外源基因的旁側序列是評估轉基因植物安全性的最重要的分子特征之一，因此，轉基因植物外源插入片段的旁側序列是評估轉基因生物安全性的重要資料。

目前，已知一些轉基因水稻外源插入載體旁側序列的相關報道，例如，謝家建等人利用TAIL-PCR、Genome?walking和LD-PCR等方法獲得了轉基因水稻克螟稻、Bt汕優63、科豐6號和科豐8號的外源插入片段的旁側序列，并建立了品系特異性的檢測方法。但是，目前為止，尚未發現任何關于轉基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁側序列的相關報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種轉基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁側序列及其應用。

本發明的另一目的是提供一種轉基因水稻Bar68-1的品系特異性PCR檢測方法。

本發明的進一步目的是提供用于檢測轉基因水稻品系Bar68-1的特異性引物及含有該引物的檢測試劑盒。

為了實現本發明目的，本發明的轉基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁側序列，所述旁側序列為3’端旁側序列，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，或與SEQ?ID?NO.1所示的序列同源性在99％以上的核苷酸序列。

所述3’端旁側序列的制備方法：以轉基因水稻品系Bar68-1的基因組DNA為模板，通過hi?TAIL-PCR擴增得到。

本發明的轉基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁側序列，所述旁側序列為5’端旁側序列，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，或與SEQ?ID?NO.2所示的序列同源性在99％以上的核苷酸序列。

所述5’端旁側序列的制備方法：以轉基因水稻品系Bar68-1的基因組DNA為模板，通過hi?TAIL-PCR和PCR擴增得到。

根據SEQ?ID?NO.1中第1-318位核苷酸序列設計正向引物，根據SEQ?ID?NO.1的第319-1099位核苷酸序列設計反向引物，建立轉基因水稻Bar68-1品系特異性的定性PCR檢測方法：

所述正向引物為Bar-F：5′-CCATATTCAGCTCGCCTTGC-3′；

所述反向引物為Bar-R：5′TGGTTTTTGTTGTCCGTGCCT-3′。

前述的方法包括以下步驟：1)提取植物基因組；2)以步驟1)的基因組為模板，利用上述特異性引物Bar-F和Bar-R進行PCR檢測。

優選的PCR反應條件為：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35個循環；72℃7min。

優選的PCR反應體系如表1所示：

表1PCR反應體系