[發明專利]可制成靜息細胞的重復發酵生產聚蘋果酸的方法

無效

• 申請號: 201110206116.7
• 申請日: 2011-07-22
• 公開（公告）號: CN102286555A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 劉云;徐勇虎;李睿穎;國華;胡婭君;王永樂;王曉瓊;范婷
• 申請（專利權）人: 天津實發中科百奧工業生物技術有限公司
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12R1/645
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 劉英蘭

技術領域

本發明涉及一種發酵生產聚蘋果酸的方法，特別涉及一種可制成靜息細胞的重復發酵生產聚蘋果酸的方法。

背景技術

聚蘋果酸（polymalic?acid，PMLA）是一種具有優良生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性的聚合物，最初由Shimada等于1969年研究一種圓弧青霉菌時發現。它作為一種水溶性脂肪族聚酯，具有高度水溶性、化學衍生性，聚蘋果酸可在水溶液中自發或酶促降解生成小分子L-蘋果酸，該L-蘋果酸單體可被人體吸收并無任何毒副作用。聚蘋果酸分解和燃燒后，最終產物是二氧化碳和水，可被植物吸收，對環境無毒無害。聚蘋果酸的諸多特性使其在醫學和藥學等領域的研究中得到日益廣泛的關注。理論研究表明，聚蘋果酸及其衍生物可望作為手術縫合線、組織工程支架材料、藥物控制釋放體系等在生物醫藥領域獲得重要應用。

目前已經可以用化學合成或從特定的微生物中得到這種高分子。國內利用微生物發酵生產聚蘋果酸一般采用的是一步發酵法或補料發酵法，生產周期為9天，最高產量為37g/L；日本采用靜息細胞法發酵，歷時5天，最高產量是80g/L。

由于生產成本非常高，合成的聚蘋果酸和天然的聚蘋果酸還是比較難得到，因此提供一種高效的、低成本的可制成靜息細胞的重復發酵生產聚蘋果酸的方法，是該技術領域科研人員急需開發的新課題之一。

發明內容

本發明的目的在于克服上述已有技術的不足之處，提供一種高效可行并可降低聚蘋果酸生產成本，減小投資，降低成本，益于生產應用的可制成靜息細胞的重復發酵生產聚蘋果酸的方法。

為實現上述目的本發明所采用的實施方式如下：一種可制成靜息細胞的重復發酵生產聚蘋果酸的方法，該方法是出芽短梗霉經一級種子培養后轉移到無菌發酵培養基中，發酵初期不控制pH，當菌絲球出現后控制發酵液pH促進聚蘋果酸的合成，然后放出發酵罐中的無菌體發酵液，后加入新鮮的無菌發酵培養基進行重復發酵，重復發酵次數為4-5批次；用無菌的磷酸緩沖液洗滌發酵罐中的菌體制成靜息細胞，加入無菌的無氮源發酵培養基進行靜息細胞法發酵生產聚蘋果酸。

具體實施步驟如下：

（1）斜面菌種制備：將出芽短梗霉TJZKBIO153接種到無菌斜面上，在28-30℃恒溫培養48-60h，直至出現黑色孢子；斜面培養基組成包括，單位1L：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，用蒸餾水定容至1L，pH值5.6；其中所用菌種：出芽短梗酶（Aureobasidium）TJZKBA10326；

（2）種子液制備：挑取一環上述的出芽短梗霉TJZKBIO153斜面菌種接入種子培養基，在28-30℃培養48-60h后出現3-5mm菌絲球，用2-6層無菌紗布過濾除去菌絲球獲得濾液即種子液，種子液濃度為10⁶-10⁷個/mL；種子培養基中的碳源為葡萄糖，碳源濃度為6%-8%；有機氮源為玉米漿、酵母粉、蛋白胨、玉米漿粉中的一種或其兩種以上的組合物，無機氮源為丁二酸銨，總氮源濃度為0.35%-0.5%；種子培養基中含有鋅、鎂、鉀無機鹽元素的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽，使用量分別為5mg/L-0.5g/L，添加合成聚蘋果酸的前體物質為丁二酸、馬來酸的一種或兩種的組合，總使用量為0.2-0.5%，115℃、15min滅菌；500ml規格的搖瓶裝液量是100ml，轉速為200-230rpm；

（3）發酵培養基滅菌：5L發酵罐中加入2.5L發酵培養基，115℃、15min滅菌后，pH5.0-5.5，冷卻至28-30℃后備用；發酵培養基中的碳源為葡萄糖，碳源濃度為12%-16%；有機氮源為玉米漿、酵母粉、蛋白胨、玉米漿粉中的一種或其兩種以上的組合物，無機氮源為丁二酸銨，總氮源濃度為0.35%-0.5%；發酵培養基中含有鋅、鎂無機鹽元素的鹽酸鹽、硫酸鹽，使用量分別為5mg/L-0.1g/L，添加合成聚蘋果酸的前體物質為丁二酸、馬來酸的一種或兩種的組合，總使用量為0.2-0.5%；

（4）發酵：上述種子液用于接種至滅菌后的5L發酵罐中，接種量為8%-12%，發酵前期的12-16h不控制發酵液的pH，直至有直徑為3mm-5mm的菌絲球長出，后通過連續流加質量濃度為5%-10%NaOH無菌溶液控制發酵液pH5.0-5.5，控制整個發酵過程中的溫度為28-30℃，通氣量為3-3.5L/min，發酵48h后每隔2-4h檢測發酵中葡萄糖的含量；