[發明專利]可制成靜息細胞的重復發酵生產聚蘋果酸的方法

無效

• 申請號: 201110206116.7
• 申請日: 2011-07-22
• 公開（公告）號: CN102286555A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 劉云;徐勇虎;李睿穎;國華;胡婭君;王永樂;王曉瓊;范婷
• 申請（專利權）人: 天津實發中科百奧工業生物技術有限公司
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12R1/645
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 劉英蘭

1.一種可制成靜息細胞的重復發酵生產聚蘋果酸的方法，其特征在于

具體實施步驟如下：

（1）斜面菌種制備：將出芽短梗霉TJZKBIO153接種到無菌斜面上，在28-30℃恒溫培養48-60h，直至出現黑色孢子；

（2）種子液制備：挑取一環出芽短梗霉TJZKBIO153斜面菌種接入種子培養基，在28-30℃培養48-60h后，用無菌紗布過濾菌絲體獲得濾液即種子液；

（3）發酵培養基滅菌：5L發酵罐中加入2.5L發酵培養基，115℃、15min滅菌后冷卻至28-30℃；

（4）發酵：發酵前期不控制發酵液pH，直至有菌絲球出現后連續流加NaOH控制發酵液的pH值至5.0-5.5，控制整個發酵過程中的溫度為28-30℃，通氣量為3-3.5L/min，發酵48h后每隔2-4h檢測發酵中葡萄糖的含量；?

（5）放料、加料：發酵55-60h后，取樣測定發酵液中葡萄糖的濃度為8-10g/L時，從發酵罐中放出發酵液，然后加入2.5L新鮮的無菌發酵培養基進行重復發酵；

（6）靜息細胞制備：發酵結束放出全部發酵液后用無菌的磷酸緩沖液洗滌菌體兩次，制成靜息細胞；

（7）靜息細胞發酵：將2.5L無氮源發酵培養液添加到5L發酵罐中，控制發酵溫度28℃-30℃，通氣量為3-3.5L/min，待pH下降到4.8-5.0后通過連續流加NaOH控制發酵液的pH值至5.0-5.5?發酵48h后每隔2-4h檢測發酵中葡萄糖的含量，至發酵液中葡萄糖濃度為8-10g/L，結束發酵；

（8）聚蘋果酸的提取：發酵液使用截留分子量為6000Da的中空纖維膜過濾，濾液用等體積的無水乙醇沉淀，烘干稱重，得到聚蘋果酸的產量為50-57g/L。

2.根據權利要求1所述的可制成靜息細胞的重復發酵生產聚蘋果酸的方法，其特征在于：從種子液到發酵罐的接種量為8%-12%?v/v，菌種濃度為10⁶-10⁷個/mL。

3.根據權利要求1所述的可制成靜息細胞的重復發酵生產聚蘋果酸的方法，其特征在于：所述種子培養基中的碳源為葡萄糖，碳源濃度為6%-8%；所述種子培養基中的有機氮源為玉米漿、酵母粉、蛋白胨、玉米漿粉中的一種或其兩種以上的任意配比組合物，無機氮源為丁二酸銨，總氮源濃度為0.35%-0.5%；所述種子培養基中含有鋅、鎂、鉀無機鹽元素的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽，使用量分別為5mg/L-0.5g/L，添加合成聚蘋果酸的前體物質為丁二酸、馬來酸的一種或兩種的組合，總使用量為0.2-0.5%，此培養基經115℃、15min滅菌后，pH5.0-5.5，冷卻至28-30℃。

4.根據權利要求1所述的可制成靜息細胞的重復發酵生產聚蘋果酸的方法，其特征在于：所述發酵培養基中的碳源為葡萄糖，碳源濃度為12%-16%；所述發酵培養基中含有鋅、鎂無機鹽元素的鹽酸鹽、硫酸鹽，使用量分別為5mg/L-0.1g/L，添加合成聚蘋果酸的前體物質為丁二酸、馬來酸的一種或兩種的組合，總使用量為0.2-0.5%，此培養基經115℃、15min滅菌后，pH5.0-5.5，冷卻至28-30℃。

5.根據權利要求1所述的可制成靜息細胞的重復發酵生產聚蘋果酸的方法，其特征在于：所述的發酵前期的12-16h不控制發酵液的pH，直至有直徑為3mm-5mm的菌絲球長出，后通過連續流加質量濃度為5%-10%NaOH無菌溶液控制發酵液pH5.0-5.5。

6.根據權利要求1所述的可制成靜息細胞的重復發酵生產聚蘋果酸的方法，其特征在于：所述的發酵時間55-60h，發酵液中的葡萄糖濃度為8-10g/L時開始放料，放出全部的發酵液后重新加入新鮮無菌的發酵培養基進行發酵，所述的發酵是在發酵液pH降至4.8-5.0，后通過連續流加質量濃度為5%-10%NaOH無菌溶液控制發酵液pH5.0-5.5的條件下重復發酵，所述的重復發酵次數為4-5批次。

7.根據權利要求1所述的可制成靜息細胞的重復發酵生產聚蘋果酸的方法，其特征在于：所述的靜息細胞的制備是在第一次發酵結束放出全部發酵液后，用0.1-0.2mol/L?pH7.0的磷酸緩沖液洗滌菌體1-2次，所述的磷酸鹽緩沖液為鈉鹽或鉀鹽的磷酸鹽緩沖液。

8.根據權利要求1所述的可制成靜息細胞的重復發酵生產聚蘋果酸的方法，其特征在于：所述的靜息細胞發酵培養基的碳源為葡萄糖，碳源濃度為12%-16%；所述的靜息細胞發酵培養基中含有鋅、鎂無機鹽元素的鹽酸鹽、硫酸鹽，使用量分別為5mg/L-0.1g/L，溶劑為0.1-0.2mol/L?pH7.0的鈉鹽或鉀鹽的磷酸鹽緩沖液，此培養基經115℃、15min滅菌后，pH7.0，冷卻至28-30℃。