[發(fā)明專利]一種丙型肝炎病毒基因的克隆方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110205242.0
• 申請日: 2011-07-21
• 公開（公告）號: CN102250885A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發(fā)明（設計）人: 蔡慶賢;高志良;趙志新;張曉紅;林潮雙;鄧洪
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬第三醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

技術領域

本發(fā)明涉及一種病毒的基因克隆方法，特別涉及一種丙型肝炎病毒基因的克隆方法。

背景技術

丙型肝炎病毒(hepatitis?C?virus，HCV)是一組人類肝炎病毒，與其他的瘟病毒，黃病毒具有類似的基因組結(jié)構。

世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的最近數(shù)據(jù)表明，全球約有1.2億人感染丙型肝炎病毒(hepatitis?C?virus，HCV)，流行率為2%。我國一般人群抗-HCV流行率為3.2%，估計有3800萬HCV感染者。近年來，我國丙型肝炎的診斷率在不斷的提高，丙型肝炎新報告病例也不斷增加。HCV感染人體后病情隱匿，慢性化率高達50%-80%，引起肝臟的慢性炎癥壞死和纖維化，導致部分患者發(fā)生肝硬化和肝癌，嚴重危害患者的健康和生命。

HCV的基因組呈高度異質(zhì)性，根據(jù)HCV基因組核苷酸序列的差異程度，可以將HCV分為多個亞型。現(xiàn)研究已知HCV基因組高度的變異性是HCV持續(xù)感染及嚴重預后的重要因素，且HCV基因型與感染途徑、臨床病情及抗病毒治療、疫苗制備等有明顯的相互關系。

為準確確實HCV的亞型，前提是獲得其病毒序列，要獲得其病毒序列，就需要一種可以有效克隆其病毒序列的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種HCV病毒基因的克隆方法。

本發(fā)明所采取的技術方案是：

一種丙型肝炎病毒基因的克隆方法，包括以下步驟：

1)??從血清樣品中提取HCV的RNA；

2)??將提取得到的RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；

3)??使用反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，引物P1:ACTGCCTGATAGGGTGCTTGC（SEQ?ID?NO：1），?P2:ATGTACCCCATGAGGTCGGC（SEQ?ID?NO：2）、P3:AGGTCTCGTAGACCGTGCA（SEQ?ID?NO：3）、P4:CATGTGAGGGTATCGATGAC（SEQ?ID?NO：4）和P5:?TATGAYACCCGYTGCTTTGAC（SEQ?ID?NO：5）、P6:GAGGAGCAAGATGTTATCAGCTC（SEQ?ID?NO：6）、P7:TATGAYACCCGYTGCTTTGAC（SEQ?ID?NO：7）和P8:?GAATACCTGGTCATAGCCTCCG（SEQ?ID?NO：8）分別進行巢式PCR，擴增丙肝病毒的core和NS5B基因片段。

優(yōu)選的，HCV?RNA的提取方法包括如下步驟：

1)??在滅菌的1.5mL?EP管中加入600?μl?RNAiso??Plus，加入血清500μl，渦旋震蕩均勻，冰上靜置5min；

2)??向上述步驟的勻漿裂解液中加入200μl氯仿，蓋緊后劇烈振蕩15秒，待溶液充分乳化后，在冰上靜置5分鐘；

3)??4℃，13000rpm高速離心樣品15?min后，將上層水相移至新管中，然后加入等體積的異丙醇，冰上放置10min；

4)??4℃，13000rpm離心10?min，棄上清，加入600μl使用DEPC水配制的75%（v/v）乙醇洗滌沉淀；

5)??4℃，13000rpm離心5min，棄上清，空氣干燥RNA?10?min，用10μl??DEPC水溶解RNA，得到用于反轉(zhuǎn)錄的RNA。

優(yōu)選的，RNA反轉(zhuǎn)錄的步驟如下：

1)??向0.2?μl?PCR管中加入1μl?Random?Primers?(25?pmol/μl)，再加入10μl的RNA溶液和1μl?RNase?Free水，混勻后65℃水浴5min后迅速置冰上冷卻2min；

2)??簡短離心收集變性后的RNA溶液，加入4μl?5×RT?Buffer、2μl?10?mM?dNTP、1μl?ReverTra?Ace-α反轉(zhuǎn)錄酶(100U/μl)和1μl?RNA酶抑制劑（10U/μl），震蕩混勻；

3)??將反應液放入PCR儀上進行反轉(zhuǎn)錄，反應程序：30℃?10min，42℃?20min，99℃?5min，4℃?5min；

4)??離心，得到用于PCR擴增的cDNA

優(yōu)選的，巢式PCR的外輪反應體系為：10×?PCR?Buffer?3?μl，2.5?mM?dNTP?2?μl，dH₂O?17.6?μl，引物（10?pmol/μl）各1.5?μl，Taq酶（2.5?U/μl）0.4?μl，模板cDNA?4?μl。