[發(fā)明專利]一種丙型肝炎病毒基因的克隆方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110205242.0
• 申請日: 2011-07-21
• 公開（公告）號: CN102250885A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡慶賢;高志良;趙志新;張曉紅;林潮雙;鄧洪
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

1.一種丙型肝炎病毒基因的克隆方法，包括以下步驟：

1)從血清樣品中提取HCV的RNA；

2)將提取得到的RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；

3)使用反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，引物P1:ACTGCCTGATAGGGTGCTTGC（SEQ?ID?NO：1），?P2:ATGTACCCCATGAGGTCGGC（SEQ?ID?NO：2）、P3:AGGTCTCGTAGACCGTGCA（SEQ?ID?NO：3）、P4:CATGTGAGGGTATCGATGAC（SEQ?ID?NO：4）和P5:?TATGAYACCCGYTGCTTTGAC（SEQ?ID?NO：5）、P6:GAGGAGCAAGATGTTATCAGCTC（SEQ?ID?NO：6）、P7:TATGAYACCCGYTGCTTTGAC（SEQ?ID?NO：7）和P8:?GAATACCTGGTCATAGCCTCCG（SEQ?ID?NO：8）分別進行巢式PCR，擴增丙肝病毒的core和NS5B基因片段。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丙型肝炎病毒基因的克隆方法，其特征在于：HCV?RNA的提取方法包括如下步驟：

1)在滅菌的1.5mL?EP管中加入600?μl?RNAiso??Plus，加入血清500μl，渦旋震蕩均勻，冰上靜置5min；

2)向上述步驟的勻漿裂解液中加入200μl氯仿，蓋緊后劇烈振蕩15秒，待溶液充分乳化后，在冰上靜置5分鐘；

3)4℃，13000rpm高速離心樣品15?min后，將上層水相移至新管中，然后加入等體積的異丙醇，冰上放置10min；

4)4℃，13000rpm離心10?min，棄上清，加入600μl使用DEPC水配制的75%（v/v）乙醇洗滌沉淀；

5)4℃，13000rpm離心5min，棄上清，空氣干燥RNA?10?min，用10μl??DEPC水溶解RNA，得到用于反轉(zhuǎn)錄的RNA。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丙型肝炎病毒基因的克隆方法，其特征在于：RNA反轉(zhuǎn)錄的步驟如下：

1)向0.2?μl?PCR管中加入1μl?Random?Primers?(25?pmol/μl)，再加入10μl的RNA溶液和1μl?RNase?Free水，混勻后65℃水浴5min后迅速置冰上冷卻2min；

2)簡短離心收集變性后的RNA溶液，加入4μl?5×RT?Buffer、2μl?10?mM?dNTP、1μl?ReverTra?Ace-α反轉(zhuǎn)錄酶(100U/μl)和1μl?RNA酶抑制劑（10U/μl），震蕩混勻；

3)將反應(yīng)液放入PCR儀上進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)程序：30℃?10min，42℃?20min，99℃?5min，4℃?5min；

4)離心，得到用于PCR擴增的cDNA。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丙型肝炎病毒基因的克隆方法，其特征在于：巢式PCR的外輪反應(yīng)體系為：10×?PCR?Buffer?3?μl，2.5?mM?dNTP?2?μl，dH₂O?17.6?μl，引物（10?pmol/μl）各1.5?μl，Taq酶（2.5?U/μl）0.4?μl，模板cDNA?4?μl。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丙型肝炎病毒基因的克隆方法，其特征在于：巢式PCR的內(nèi)輪PCR體系為：10×?PCR?Buffer?3?μl，2.5?mM?dNTP?2?μl，dH₂O?19.6?μl，引物（10?pmol/μl）各1.5?μl，Taq酶（2.5?U/μl）0.4?μl，模板cDNA?2?μl。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丙型肝炎病毒基因的克隆方法，其特征在于：巢式PCR的兩輪PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5?min；94℃變性30?sec，55℃退火1?min，72℃延伸40?sec，30個循環(huán)；72℃延伸10min。