[發(fā)明專利]豬卵丘干細(xì)胞的分離方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110204169.5
• 申請(qǐng)日: 2011-07-20
• 公開（公告）號(hào): CN102268404A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹鴻國(guó);章孝榮;蒲勇;楊盼;張運(yùn)海;劉亞;陶勇;方富貴;李運(yùn)生;任春環(huán);張子軍;丁建平;劉洪瑜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/074
• 分類號(hào): C12N5/074
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• 代理人: 暫無信息

[技術(shù)領(lǐng)域]

本發(fā)明涉及動(dòng)物干細(xì)胞的分離方法，尤其涉及一種豬卵丘干細(xì)胞的分離方法。

[背景技術(shù)]

干細(xì)胞(Stem?Cell)是一種尚未充分分化和成熟的細(xì)胞，在誘導(dǎo)環(huán)境條件下具有形成各種組織器官組成細(xì)胞的潛在功能，被醫(yī)學(xué)界稱之為“萬能細(xì)胞”。干細(xì)胞的用途非常廣泛，涉及到醫(yī)學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域。干細(xì)胞及其衍生組織器官的廣泛臨床應(yīng)用，將產(chǎn)生一種全新的醫(yī)療技術(shù)，也就是再造人體正常的甚至年輕的組織器官，從而使人類能夠用上自己的或他人的干細(xì)胞或由干細(xì)胞所衍生出的新的組織器官，來替換自身病變的或衰老的組織器官。干細(xì)胞的研究將為臨床醫(yī)學(xué)提供更為廣闊的應(yīng)用前景。隨著基因工程、胚胎工程、細(xì)胞工程等各種生物技術(shù)的快速發(fā)展，按照一定的目的，在體外人工分離、培養(yǎng)干細(xì)胞已成為可能，利用干細(xì)胞構(gòu)建各種細(xì)胞、組織、器官作為移植器官的來源，這將成為干細(xì)胞應(yīng)用的主要方向。當(dāng)前，干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)的研究已成為生命科學(xué)中最為引人注目的領(lǐng)域，其理論的日臻完善和技術(shù)的迅猛發(fā)展必將在疾病治療和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域產(chǎn)生劃時(shí)代的成果，是對(duì)傳統(tǒng)醫(yī)療手段和醫(yī)療觀念的一場(chǎng)重大革命。

干細(xì)胞作為起源細(xì)胞，具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的原始未分化細(xì)胞，是形成哺乳類各組織器官的祖宗細(xì)胞。干細(xì)胞在形態(tài)上通常具有共性，呈現(xiàn)出圓形或橢圓形形態(tài)，干細(xì)胞的體積較小，細(xì)胞核相對(duì)較高大。干細(xì)胞按其來源可以分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞(Embryonic?Stem?cell，ES細(xì)胞)來自早期受精卵囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，ES細(xì)胞是一種高度未分化細(xì)胞。它具有發(fā)育的全能性，能分化形成動(dòng)物機(jī)體組織和器官的所有組成細(xì)胞，甚至包括生殖細(xì)胞精子和卵子。因此，研究和利用ES細(xì)胞是當(dāng)前生物工程領(lǐng)域的熱點(diǎn)。但是由于ES細(xì)胞來源于早期囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，當(dāng)胚胎在子宮內(nèi)著床后囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)將發(fā)育成為一個(gè)生命個(gè)體。因此，ES細(xì)胞的分離與一個(gè)生命個(gè)體的誕生存在兩者不可兼得的矛盾。另外，ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成的細(xì)胞由于免疫排斥現(xiàn)象不能直接應(yīng)用到患者體內(nèi)。成體干細(xì)胞作為干細(xì)胞家族中的一種細(xì)胞類型，來源于動(dòng)物機(jī)體的許多組織或器官。成體干細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)分化后形成機(jī)體緊缺的細(xì)胞、組織或器官用于修復(fù)或替換受損的細(xì)胞、組織或器官，由于自身成體干細(xì)胞同動(dòng)物機(jī)體基因型完全一致，干細(xì)胞移植可以有效避免免疫排斥現(xiàn)象。成體干細(xì)胞在動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育過程中作為細(xì)胞儲(chǔ)備發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，維持組織或器官的動(dòng)態(tài)平衡。目前，造血干細(xì)胞作為成體干細(xì)胞已成功應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)。造血干細(xì)胞是體內(nèi)各種血細(xì)胞的唯一種子細(xì)胞來源，它主要存在于骨髓、外周血、臍帶血中。造血干細(xì)胞的移植是治療血液系統(tǒng)疾病、先天性遺傳疾病以及多發(fā)性和轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤疾病的最有效方法。造血干細(xì)胞存在于造血系統(tǒng)，對(duì)于白血病患者因造血系統(tǒng)的嚴(yán)重疾病，自身的造血干細(xì)胞受到破壞，分離培養(yǎng)出來源于其他組織或器官的成體干細(xì)胞具有著重要的使用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

目前人們已從皮膚、脂肪、神經(jīng)、血液等組織中成功地分離出成體干細(xì)胞，其中造血干細(xì)胞已成功地應(yīng)用于人類臨床。但是到目前為止還未見從動(dòng)物機(jī)體的卵巢中分離出干細(xì)胞的報(bào)道。

[發(fā)明內(nèi)容]

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種豬卵丘干細(xì)胞的分離方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，一種豬卵丘干細(xì)胞的分離方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)豬卵丘細(xì)胞的采集

從青年母豬卵巢表面抽取直徑36mm卵泡，挑選卵丘細(xì)胞包裹2層以上致密且胞質(zhì)均勻的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物，用TCM-199卵母細(xì)胞成熟液洗滌3遍，然后將每70-80個(gè)卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物移入24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，每孔400μlTCM-199卵母細(xì)胞成熟液，成熟液上面覆蓋石蠟油，在39℃、5％CO₂、100％濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42±2h；成熟培養(yǎng)后的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物用1mg/ml透明質(zhì)酸酶消化脫去卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，收集卵丘細(xì)胞用于豬卵丘干細(xì)胞的分離培養(yǎng)；

(2)豬卵丘干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

取采集到的豬卵丘細(xì)胞，經(jīng)PBS液離心洗滌后，添加高糖的DMEM培養(yǎng)液于37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待培養(yǎng)的纖維狀卵丘細(xì)胞中間出現(xiàn)圓形細(xì)胞形成的細(xì)胞集落后，更換為含4μg/ml?bFGF和10U/ml?LIF的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，胰酶消化圓形細(xì)胞集落，接種消化的細(xì)胞于小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，添加4μg/ml?bFGF和10U/ml?LIF的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞每天半量換液，2-3d傳代一次。

本發(fā)明的有益效果是：