[發(fā)明專利]豬卵丘干細(xì)胞的分離方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110204169.5
• 申請(qǐng)日: 2011-07-20
• 公開（公告）號(hào): CN102268404A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹鴻國(guó);章孝榮;蒲勇;楊盼;張運(yùn)海;劉亞;陶勇;方富貴;李運(yùn)生;任春環(huán);張子軍;丁建平;劉洪瑜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/074
• 分類號(hào): C12N5/074
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種豬卵丘干細(xì)胞的分離方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)豬卵丘細(xì)胞的采集

從青年母豬卵巢表面抽取直徑3-6mm卵泡，挑選卵丘細(xì)胞包裹2層以上致密且胞質(zhì)均勻的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物，用TCM-199卵母細(xì)胞成熟液洗滌3遍，然后將每70-80個(gè)卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物移入24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，每孔400μlTCM-199卵母細(xì)胞成熟液，成熟液上面覆蓋石蠟油，在39℃、5％CO₂、100％濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42±2h；成熟培養(yǎng)后的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物用1mg/ml透明質(zhì)酸酶消化脫去卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，收集卵丘細(xì)胞用于豬卵丘干細(xì)胞的分離培養(yǎng)；

(2)豬卵丘干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

取采集到的豬卵丘細(xì)胞，經(jīng)PBS液離心洗滌后，添加高糖的DMEM培養(yǎng)液于37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待培養(yǎng)的纖維狀卵丘細(xì)胞中間出現(xiàn)圓形細(xì)胞形成的細(xì)胞集落后，更換為含4μg/ml?bFGF和10U/ml?LIF的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，胰酶消化圓形細(xì)胞集落，接種消化的細(xì)胞于小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，添加4μg/ml?bFGF和10U/ml?LIF的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞每天半量換液，2-3d傳代一次。