[發明專利]一種含杯狀細胞的重組眼結膜上皮膜片的制備方法

有效

• 申請號: 201110204154.9
• 申請日: 2011-07-20
• 公開（公告）號: CN102266587A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發明（設計）人: 周慶軍;謝立信;王瑤;楊玲玲;田樂
• 申請（專利權）人: 山東省眼科研究所
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;C12N5/071
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

技術領域

本發明屬于眼表結膜上皮制備技術領域，具體涉及到一種含杯狀細胞的重組眼結膜上皮膜片的制備方法。

背景技術

結膜杯狀細胞是單細胞黏液腺，位于結膜上皮層，其主要功能是分泌黏蛋白，其所分泌的黏蛋白是淚膜最內層的主要成分，對維持眼表功能起重要作用。但是，若杯狀細胞受到破壞，淚液成分即出現異常，引起角結膜干燥癥，輕者感覺不適，重者導致失明。因此，在結膜大范圍損傷后，即使采用口唇粘膜、羊膜移植等種種方法克服瞼球粘連問題，也會因為不能恢復正常的杯狀細胞密度和功能，不能建立后期角膜移植術恢復視力的基礎。因此，制備含杯狀細胞的重組結膜上皮膜片，用以重建結膜結構和功能，恢復作為淚液中黏蛋白主要來源的杯狀細胞，已成為眼表重建手術一個新的發展方向，其臨床應用將為眼表疾病的治療開辟廣闊前景，具有深遠意義。但目前對含杯狀細胞的重組眼結膜上皮膜片的構建中還存在許多難題亟待解決。

發明內容

本發明的目的是提供一種含杯狀細胞的重組眼結膜上皮膜片的制備方法，即在結膜上皮膜片構建的后期，采用γ-分泌酶抑制劑誘導杯狀細胞分化，增加重組眼結膜上皮膜片中杯狀細胞的密度，促進其成熟分化，得到含正常功能和密度杯狀細胞的重組結膜上皮膜片，以彌補現有技術的不足。

本發明的含杯狀細胞的重組眼結膜上皮膜片的制備方法，其特征在于，是用γ-分泌酶抑制劑來誘導重組眼結膜上皮膜片中杯狀細胞的分化。

本發明的制備方法，包括有1)眼結膜上皮膜片的培養制備和2)杯狀細胞誘導分化成熟步驟，其特征在于，上述2)杯狀細胞誘導分化成熟步驟是在結膜上皮細胞培養液中加入終濃度為100～400nm/L的γ-分泌酶抑制劑來誘導杯狀細胞的分化。

上述的步驟1)眼結膜上皮膜片的培養制備，其步驟如下：

首先將制備好的羊膜嵌套式培養模具放入已鋪有飼養層的培養板中，然后再將處理好的結膜上皮組織接種于培養板中，再添加結膜上皮細胞培養液進行培養。

所述的飼養層制備方法如下：用絲裂霉素C處理小鼠胚胎成纖維細胞后，再消化接種到細胞培養用的6孔板中制備小鼠胚胎成纖維細胞飼養層。

步驟2)杯狀細胞誘導分化成熟，其步驟如下：將結膜上皮組織接種于培養板中培養至結膜上皮細胞融合度達到80～90％后，在結膜上皮細胞培養液中加入終濃度為100～400nm/L的γ-分泌酶抑制劑，誘導分化結膜上皮細胞1～7天，制得含杯狀細胞的眼重組結膜上皮膜片。

在結膜上皮細胞培養液中加入終濃度為200nm/L的γ-分泌酶抑制劑，結膜杯狀細胞明顯增殖，具有最好的誘導效果。

本發明的制備方法以自體結膜或異體結膜為原材料，培養制備含杯狀細胞的重組結膜上皮膜片，用于移植治療因為杯狀細胞缺乏或功能障礙為特征的眼表疾病。本發明以γ-分泌酶抑制劑誘導杯狀細胞分化，與以往的結膜上皮膜片制備方法相比，本發明的培養方法具有如下優點：1)含飼養層細胞培養，早期促進結膜上皮細胞的增殖，形成的結膜上皮復層更加均勻；2)以羊膜嵌套式培養模具為培養支架，羊膜培養面很平坦，分化的杯狀細胞存在于結膜上皮間，具有功能，臨床應用方便且羊膜不易破裂；3)γ-分泌酶抑制劑誘導杯狀細胞分化，可增加重組結膜上皮膜片中杯狀細胞的密度和分泌黏蛋白的能力，更符合臨床需求。

附圖說明

圖1：本發明的膜嵌套式培養模具的結構示意圖。

圖2：本發明的原代培養兔結膜上皮細胞陰性對照組處理照片。

圖3：本發明的原代培養兔結膜上皮細胞200nm/L的γ-分泌酶抑制劑組處理照片。

圖4：本發明的原代培養人結膜上皮細胞陰性對照組AB/PAS染色照片，紅色著色為杯狀細胞。

圖5：本發明的原代培養人結膜上皮細胞200nm/L的γ-分泌酶抑制劑組AB/PAS染色照片，紅色著色為杯狀細胞。

其中：1、嵌入式培養小室2、套筒3、羊膜片。

具體實施方式

本發明以自體結膜或異體結膜組織為原材料，用γ-分泌酶抑制劑誘導杯狀細胞分化來制備以羊膜為載體的結膜杯狀細胞膜片，制備的含杯狀細胞的眼重組結膜上皮膜片具有人結膜杯狀細胞的特性，可用于結膜杯狀細胞缺乏或功能障礙征疾病的移植治療中。

本發明的制備方法：包括有1)眼結膜上皮膜片的培養制備和2)杯狀細胞誘導分化成熟步驟，其特征在于，上述2)杯狀細胞誘導分化成熟步驟是在結膜上皮細胞培養液中加入終濃度為100～400nm/L的γ-分泌酶抑制劑。