[發(fā)明專利]一種含杯狀細胞的重組眼結膜上皮膜片的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110204154.9
• 申請日: 2011-07-20
• 公開（公告）號: CN102266587A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發(fā)明（設計）人: 周慶軍;謝立信;王瑤;楊玲玲;田樂
• 申請（專利權）人: 山東省眼科研究所
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;C12N5/071
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

1.一種含杯狀細胞的重組眼結膜上皮膜片的制備方法，其特征在于，是用γ-分泌酶抑制劑來誘導重組眼結膜上皮膜片中杯狀細胞的分化。

2.如權利要求1所述的制備方法，包括有1)眼結膜上皮膜片的培養(yǎng)制備和2)杯狀細胞誘導分化成熟步驟，其特征在于，上述2)杯狀細胞誘導分化成熟步驟是在結膜上皮細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為100～400nm/L的γ-分泌酶抑制劑來誘導杯狀細胞的分化。

3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的γ-分泌酶抑制劑終濃度優(yōu)選為200nm/L。

4.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的步驟1)眼結膜上皮膜片的培養(yǎng)制備，其具體操作如下：首先將制備好的羊膜嵌套式培養(yǎng)模具放入已鋪有飼養(yǎng)層的培養(yǎng)板中，然后再將處理好的結膜上皮組織接種于培養(yǎng)板中后，再添加結膜上皮細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的飼養(yǎng)層為小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層。

6.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的步驟2)杯狀細胞誘導分化成熟步驟，其具體操作如下：將結膜上皮組織接種于培養(yǎng)板中培養(yǎng)至結膜上皮細胞融合度達到80～90％后，在結膜上皮細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為100～400nm/L的γ-分泌酶抑制劑，誘導分化結膜上皮細胞1～7天后，制得含杯狀細胞的眼重組結膜上皮膜片。

7.如權利要求4或權利要求6所述的制備方法，其特征在于所述的結膜上皮細胞培養(yǎng)液為添加有10％FBS、20ng/mlEGF、5μg/ml胰島素、0.1μg/ml霍亂毒素、100μg/ml青鏈霉素的DMEM/HamF12培養(yǎng)基。