[發明專利]動物細胞內核蛋白提取方法

無效

• 申請號: 201110204137.5
• 申請日: 2011-07-20
• 公開（公告）號: CN102277402A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 曹鴻國;章孝榮;楊盼;蒲勇;張運海;劉亞;陶勇;方富貴;李運生;任春環;張子軍;丁建平;劉洪瑜
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/435;C07K1/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種動物細胞內核蛋白提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)核蛋白的表達

用高糖DMEM培養液培養傳代293T細胞，經過多次培養傳代后選擇生長速度快、生長狀態好的293T細胞用作核蛋白表達細胞；待293T細胞生長到對數生長期時；分別采用磷酸鈣沉淀法介導Oct4、Sox2、Myc、Klf4重組核蛋白表達載體在293T細胞內表達；

(2)核蛋白的提取

熒光顯微鏡下觀察核蛋白在293T細胞中的表達，待重組核蛋白在細胞內表達穩定后，分別選取核蛋白表達的293T細胞，去除培養皿中的高糖DMEM培養液，添加含秋水仙素的高糖DMEM培養液處理細胞，待處理細胞形態出現變化后，將293T細胞連同培養液一起收集到離心管中4℃放置；取出4℃狀態下的細胞懸液，4℃離心去上清液，用4℃預冷的高糖DMEM培養液重懸細胞沉淀，離心洗滌細胞并去上清液，用4℃預冷的高糖DMEM培養液再重懸細胞沉淀，同時加入蛋白酶抑制劑，輕輕吹打混勻后冰浴中超聲破碎細胞，4℃離心去沉淀后收集上清液過濾除菌，4℃放置備用。

2.根據權利要求1所述的動物細胞內核蛋白提取方法，其特征在于，所述的重組核蛋白表達載體的基本重組結構為pcDNA3.1-細胞穿透肽-外源核蛋白-綠色熒光蛋白。

3.根據權利要求2所述的動物細胞內核蛋白提取方法，其特征在于，所述細胞穿透肽的11個氨基酸組成為酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-賴氨酸-賴氨酸-精氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-賴氨酸-賴氨酸-賴氨酸。