[發明專利]動物細胞內核蛋白提取方法

無效

• 申請號: 201110204137.5
• 申請日: 2011-07-20
• 公開（公告）號: CN102277402A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 曹鴻國;章孝榮;楊盼;蒲勇;張運海;劉亞;陶勇;方富貴;李運生;任春環;張子軍;丁建平;劉洪瑜
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/435;C07K1/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

[技術領域]

本發明涉及蛋白質提取方法，尤其涉及一種動物細胞內核蛋白提取方法。

[背景技術]

蛋白質的制備是一項十分細致的工作，涉及物理學、化學和生物學等多門學科。蛋白質種類很多，在理化特性方面差異較大，因此不可能有一個固定的程序適用各類蛋白質的分離。動物材料中的蛋白質有些以可溶性的形式存在于體液如血液、尿液中，可以不必經過提取直接進行分離。但是一些蛋白質常以與其它生物體物質結合形式存在，如核蛋白，這給分離工作帶來了較大困難。動物細胞是由細胞膜、細胞質和細胞核三部分組成的，蛋白質在細胞膜、細胞質和細胞核內均大量存在，發揮著不同的生理功能。細胞核是細胞的中樞和指揮中心，在細胞核內表達的蛋白，即核蛋白，在三種類型的蛋白中是唯一一種同遺傳物質基因組緊密結合在一起的蛋白，核蛋白只有同基因組緊密地結合在一起才能發揮蛋白的特定功能。因此，提取保持生物活性的核蛋白在三種蛋白類型中難度最大。

細胞核內基因組DNA為粘稠的線型分子，在提取核蛋白去除基因組DNA時DNase?I是常用的降解酶。DNase?I的中文名稱為脫氧核糖核酸酶I，是一種用于消化單鏈或雙鏈DNA的核酸內切酶。DNase?I降解基因組DNA的理想條件為37℃，而細胞蛋白提取的基本條件要求在0-4℃的低溫環境條件下進行，目的是為了防止細胞蛋白快速降解，因此，核蛋白的提取要兼顧兩個不同的溫度條件是難以進行的。目前，核蛋白的提取常采用蛋白變性劑使細胞核蛋白變性而從基因組上脫落下來。但是，這種方法提取的核蛋白由于蛋白變性不具有核蛋白的生物學活性，只能用于蛋白印記、蛋白電泳、免疫共沉淀等蛋白質的常規分析檢測。另外，由于提取的蛋白液中含有蛋白變性劑，蛋白提取物中微量的蛋白變性劑即可導致培養細胞的死亡，因此不能添加到細胞培養液中開展蛋白功能應用。

[發明內容]

本發明要解決的技術問題是提供一種動物細胞內核蛋白提取方法。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是，一種動物細胞內核蛋白提取方法，包括以下步驟：

(1)核蛋白的表達

用高糖DMEM培養液培養傳代293T細胞，經過多次培養傳代后選擇生長速度快、生長狀態好的293T細胞用作核蛋白表達細胞；待293T細胞生長到對數生長期時；分別采用磷酸鈣沉淀法介導Oct4、Sox2、Myc、Klf4重組核蛋白表達載體在293T細胞內表達；

(2)核蛋白的提取

熒光顯微鏡下觀察核蛋白在293T細胞中的表達，待重組核蛋白在細胞內表達穩定后，分別選取核蛋白表達的293T細胞，去除培養皿中的高糖DMEM培養液，添加含秋水仙素的高糖DMEM培養液處理細胞，待處理細胞形態出現變化后，將293T細胞連同培養液一起收集到離心管中4℃放置；取出4℃狀態下的細胞懸液，4℃離心去上清液，用4℃預冷的高糖DMEM培養液重懸細胞沉淀，離心洗滌細胞并去上清液，用4℃預冷的高糖DMEM培養液再重懸細胞沉淀，同時加入蛋白酶抑制劑，輕輕吹打混勻后冰浴中超聲破碎細胞，4℃離心去沉淀后收集上清液過濾除菌，4℃放置備用。

上述重組核蛋白表達載體的基本重組結構為pcDNA3.1-細胞穿透肽-外源核蛋白-綠色熒光蛋白。

上述細胞穿透肽的11個氨基酸組成為酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-賴氨酸-賴氨酸-精氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-賴氨酸-賴氨酸-賴氨酸。

細胞穿透肽(Cell?penetrating?peptide，CPP)是具有穿透細胞膜或核膜后定位于細胞質或細胞核的氨基酸序列。細胞穿透肽能夠攜帶外源蛋白質或多肽進入細胞內，且不影響攜帶蛋白的生物學活性，同時不受細胞類型的影響。細胞穿透肽的氨基酸序列中具有蛋白轉導作用的基本結構是富含堿性氨基酸的多肽片段，其中精氨酸和賴氨酸殘基在細胞穿透肽功能發揮中起著重要作用。

綠色熒光蛋白(Enhanced?green?fluorescent?protin，EGFP)是熒光蛋白家族中最常用的一種，最初從水母中分離得到，發光基團主要是由絲氨酸、酪氨酸和甘氨酸三個氨基酸經過環化、氧化后形成的咪唑環，在鈣離子激發下不需要其他輔酶能夠單獨或與其它蛋白融合時產生熒光，熒光具有高度穩定性。綠色熒光蛋白由于具有自發熒光的特性，常作為熒光標記在分子生物學、細胞生物學和發育生物學等領域得到廣泛應用。