[發明專利]一種檢測腫瘤納米探針的制備方法

無效

• 申請號: 201110203537.4
• 申請日: 2011-07-20
• 公開（公告）號: CN102234679A
• 公開（公告）日: 2011-11-09
• 發明（設計）人: 張先恩;崔宗強;李可;張治平;危宏平
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;A61K49/00;A61K49/14
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明涉及腫瘤檢測技術領域，更具體涉及一種檢測腫瘤納米探針的制備方法，通過在鐵蛋白籠型結構表面展示熒光蛋白和RGD腫瘤靶向短肽，并在其內腔合成Fe₃O₄納米顆粒，制備出具有腫瘤靶向、磁性、熒光三種功能的納米顆粒探針。這種三功能納米探針能夠用于腫瘤細胞或活體的腫瘤靶向的磁共振成像(MRI)和熒光成像等檢測。?

背景技術

癌癥是人類死亡主要原因之一。盡管腫瘤生物學和腫瘤醫學有了很大的發展，比如：腫瘤生物標記物的發現，簡便的手術流程，放療和化療的發展，但是總癌癥存活率在過去的二十年中都沒有顯著的提高。為了提高腫瘤患者的存活率，我們急需發展新的腫瘤早期診斷方法和治療方法。?

納米科學和技術的發展帶動了用于分子細胞成像和癌癥治療的納米材料的發展，也帶動了用于癌癥檢測和篩查的納米器件的開發。納米顆粒不僅能提供癌癥病人的高靈敏和特異性成像信息，而且還能運輸抗癌藥物到腫瘤的位置。當前，我們在以下這三個方面的認識還是有限的：一是適合用來成像的生物標記物；二是成像靶標和反差增強材料的選擇；三是用來使成像探針生物化的化學方法。我們在發展癌癥特異性成像試劑上同樣遇到很多困難，比如：1)靶向組織或腫瘤的探針的運輸；2)生物相容性和生物毒性；3)探針的穩定性和體內信號增強的有效性；4)足夠多的成像方法和策略。?

當今，腫瘤靶向性的納米探針的發展也存在很大的挑戰。磁共振成像(Magneticresonance?imaging，MRI)是一種很好的成像方式，提供了細膩的軟組織對比度，能夠揭示組織形態學和解剖學上的細節，甚至可以用于動物和人的全身成像。磁性造影劑常被用來增強反差和放大信號。雖然釓-二乙烯三胺五乙酸(Gd-DTPA)有很強的縮短T1值的效應而且在臨床上被廣泛接受，但是它反差效應相對較低且體內存留時間過短。細胞內吞釓時和內吞釓后的毒性和生物相容性還是未知的。最近，磁性氧化鐵納米顆粒成為新一代的靶向特異性的MRI?T2造影劑。磁性氧化鐵納米顆粒比Gd-DTPA在促進弛豫方面更有效。磁性氧化鐵納米顆粒的磁學性質可以通過控制核心的大小和表面修飾物來操控。更重要的是，磁性氧化鐵納米顆粒具有很長的血液存留時間，生物降解性和低生物毒性等特性。?

盡管我們在發展基于磁性氧化鐵納米顆粒的MRI造影劑方面做出了很多努?力，但是很多難題依然存在。主要的難題是發展一種表面修飾材料，該材料不僅可以穩定納米顆粒還可以提供用于探針分子可控生物交聯的活性功能基團。傳統的用于穩定磁性氧化鐵納米顆粒的分子(如：葡聚糖)由于與納米顆粒間的相互作用力弱，所以很容易從納米顆粒的表面脫落下來而導致納米顆粒在生理條件下和儲存期間的團聚、沉淀。?

同時，雖然MRI是腫瘤學的一種主要成像方法，但是用于分子和細胞成像時它的分辨率很有限。而且，單獨的MRI造影劑如磁性氧化鐵納米顆粒難以靶向腫瘤細胞或組織。?

鐵蛋白是一個由24個結構相同的亞基自組裝形成的八面體對稱的球狀蛋白籠形結構。鐵蛋白的外部直徑是12nm，內部是一個6-8nm的空腔。鐵蛋白同SV40一樣也是一種典型的蛋白籠形結構。內源性人類鐵蛋白有兩種不同的亞基組成，H鏈和L鏈，H鏈和L鏈的分子量大小不同，分別是21kDa和19kDa。H鏈含有一個保守的亞鐵氧化酶的酶活性位點，可以催化兩個Fe²⁺氧化；L鏈內部帶有大量的負電荷，參與鐵氧化物核心的形成。在哺乳動物鐵蛋白的H鏈內有一個能催化Fe²⁺氧化成Fe³⁺的亞鐵氧化酶。哺乳動物鐵蛋白的H鏈單獨也能自組裝成24聚體球狀蛋白籠形結構。鐵蛋白的氨基端伸向外表面，非常易于基因操作，融合各種蛋白和短肽。?

所以，嘗試基于鐵蛋白籠型結構發展一種具有腫瘤靶向、磁性、熒光等三種功能的納米顆粒，用于腫瘤靶向的磁共振成像和熒光成像。?

發明內容

本發明的目的是在于提供了一種檢測腫瘤納米探針的制備方法，在鐵蛋白H鏈的氨基端融合一個綠色熒光蛋白(GFP)，然后再融合一段RGD腫瘤靶向短肽。純化好的帶有腫瘤靶向肽和GFP的鐵蛋白，再在其內腔合成Fe₃O₄納米顆粒，從而發展具有腫瘤靶向、磁性、熒光等三種功能的納米顆粒探針一種的三功能納米顆粒。這種三功能納米探針能夠用于腫瘤的活細胞或活體的腫瘤靶向的磁共振成像(MRI)和熒光成像等腫瘤的方便檢測。?

為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施：?

一種檢測腫瘤納米探針的制備方法，其步驟是：?