[發明專利]一種檢測腫瘤納米探針的制備方法

無效

• 申請號: 201110203537.4
• 申請日: 2011-07-20
• 公開（公告）號: CN102234679A
• 公開（公告）日: 2011-11-09
• 發明（設計）人: 張先恩;崔宗強;李可;張治平;危宏平
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;A61K49/00;A61K49/14
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種檢測腫瘤納米探針的制備方法，其步驟是：

A、通過聚合酶鏈式反應擴增合成人鐵蛋白重鏈基因rHF，插入到表達載體pET-28a上，構建出表達鐵蛋白重鏈的表達質粒pET-rHF，轉化入大腸桿菌E.?coli?BL21?(λDE3)，37?℃恒溫、200?r/min?振蕩培養培養至OD600?在0.4?~?0.6?之間，向培養物加IPTG?至終濃度1?mmol/L，培養物均在25?℃繼續誘導培養8?h?后，4?℃、6000?g?離心收集細胞，細胞沉淀以Tris-HCl?緩沖液：20?mM?Tris-HCl，50?mM?NaCl，pH?8.0，清洗菌體一次，然后重懸于30?mLTris-HCl?緩沖液中，超聲破碎后，以12000?r/min離心30?min，收集上清液置于60?℃水浴中反應10?min，然后12000?r/min?離心20?min，收集上清液用Amicon?Ultra15?超濾管濃縮，濃縮的蛋白樣品用分子篩柱Superdex?200?10/300?GL?或Superose?6?10/300?GL?純化，收集洗脫峰,獲得純化的籠型結構的鐵蛋；

B、質粒pET-rHF中插入綠色熒光蛋白基因，構建表達鐵蛋白與綠色熒光蛋白的融合蛋白的表達質粒pET-GFP-rHF，大腸桿菌E.?coli?BL21?(λDE3)表達、純化融合蛋白，制備出表面展示了熒光蛋白的鐵蛋白籠型結構；

C、在質粒pET-GFP-rHF中插入RGD短肽表達基因，構建表達鐵蛋白-綠色熒光蛋白-腫瘤靶向肽RGD的融合蛋白的表達質粒pET28a-RGF，大腸桿菌E.?coli?BL21?(λDE3)表達、純化融合蛋白，制備出表面同時展示了熒光蛋白和腫瘤靶向肽的鐵蛋白籠型結構；

D、基于表面同時展示了熒光蛋白和腫瘤靶向肽的鐵蛋白籠型結構，在其內腔合成Fe₃O₄納米顆粒，方法為：30?mL?0.4?μM?rHF?蛋白或GFP-rHF?蛋白或RGF?蛋白的NaCl溶液脫氣后加到滴定儀的反應杯中，通入高純氮氣，置于65?℃恒溫水浴中，采用滴定儀恒滴定模式，整個反應過程反應液的pH?值用50?mM?的NaOH?滴定控制在8.5，12.5?mM?的硫酸亞鐵銨和4.17?mM?的H2O2新鮮配制溶液同時以0.16?mL/min?的速度加入到上述反應液中，30?分鐘后停止滴加，使反應液中每個蛋白籠形結構的理論鐵原子載量達到5000，反應液在停止滴加后繼續反應5分鐘，然后加入0.6?mL?0.3?M?的檸檬酸鈉溶液螯合掉多余的鐵離子，接著降溫到室溫，成功獲得內腔合成Fe₃O₄納米顆粒的鐵蛋白探針，鐵蛋白籠型結構表面展示了熒光蛋白和腫瘤靶向肽，再加上內腔的Fe₃O₄納米顆粒，為完整的腫瘤靶向、熒光、磁性的鐵蛋白多功能探針。