[發(fā)明專利]用于口蹄疫病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的引物和方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110203471.9
• 申請(qǐng)日: 2011-07-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102260750A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邱楊;黃偉;劉建麗;趙麗;陳進(jìn)會(huì);林濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東莞出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 連平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于口蹄疫病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的引物和方法。

背景技術(shù)

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth?Disease?Virus，F(xiàn)MDV)屬小RNA病毒科屬，是最小的動(dòng)物病毒之一。口蹄疫病毒是偶蹄獸共患的一種急性、熱性、接觸性的烈性傳染病，最易感染的動(dòng)物是豬、黃牛、水牛、駱駝、羊、鹿等，黃羊、麝、野豬、野牛等野生動(dòng)物也易感染此病。此病由于有高傳染性、高死亡率的特點(diǎn)，所以傳染范圍大，速度快，且病毒生命力極強(qiáng)，一旦爆發(fā)，必須迅速撲殺病畜及可疑感染動(dòng)物，并對(duì)疫區(qū)進(jìn)行徹底消毒。因此，口蹄疫病毒的每次爆發(fā)流行，都意味著巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)發(fā)展中國(guó)家的農(nóng)業(yè)部經(jīng)濟(jì)而言，更是一場(chǎng)不可預(yù)估的毀滅性災(zāi)難。

口蹄疫病毒共有O、A、C、Asia?I、SAT1、SAT2和SAT3等7個(gè)血清型，而每個(gè)血清型中又有許多的亞型，由于各個(gè)血清型之間交叉保護(hù)較少，因此，每次疫病爆發(fā)后只能進(jìn)行屠宰和集體焚毀，以絕后患。2001年英國(guó)在爆發(fā)口蹄疫病毒的一個(gè)多月期間，大約30萬(wàn)頭牲畜已被宰殺，口蹄疫病毒危機(jī)使英國(guó)的經(jīng)濟(jì)損失將達(dá)到100億美元，隨后三周內(nèi)還有近100萬(wàn)頭牲畜被宰殺銷(xiāo)毀。2003年巴拉圭政府命令槍殺感染口蹄疫病毒的300多頭牛羊，這場(chǎng)災(zāi)難給這個(gè)南美國(guó)家造成5000多萬(wàn)美元的直接損失。2005年巴西口蹄疫病毒發(fā)生，世界41個(gè)國(guó)家宣布暫時(shí)禁止從巴西進(jìn)口牛肉，造成損失約5億美元，如果情況繼續(xù)發(fā)展下去，2006年將損失10億美元以上。可見(jiàn)口蹄疫病毒傳播迅速、難于防治、補(bǔ)救措施少，被稱為畜牧業(yè)的“頭號(hào)殺手”，嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

口蹄疫的暴發(fā)往往給國(guó)家的經(jīng)濟(jì)帶來(lái)致命的打擊。1951-1952年在英法爆發(fā)的口蹄疫，造成的損失高達(dá)1.43億英鎊。因此世界各國(guó)都將其列為一類傳染病認(rèn)真對(duì)待，并采取積極措施防止發(fā)生和防范從國(guó)外傳入。1967年英國(guó)口蹄疫大爆發(fā)導(dǎo)致40萬(wàn)頭牛被屠宰，損失1.5億英鎊。最近一段時(shí)間，在東南亞地區(qū)多次爆發(fā)口蹄疫，損失嚴(yán)重，僅臺(tái)灣地區(qū)就宰殺豬超過(guò)20萬(wàn)頭。1997年，臺(tái)灣爆發(fā)O型口蹄疫，當(dāng)局被迫銷(xiāo)毀340萬(wàn)頭生豬，以防疫情進(jìn)一步擴(kuò)大。此次殺豬行動(dòng)導(dǎo)致臺(tái)灣相關(guān)行業(yè)蒙受2700億元新臺(tái)幣損失。2000年英國(guó)已宰殺了近10萬(wàn)頭牲畜后，口蹄疫席卷整個(gè)歐洲和世界上的其他國(guó)家。韓國(guó)、日本暴發(fā)口蹄疫后，韓國(guó)政府決定投入5000億韓元(5.2億美元)收購(gòu)并宰殺口蹄疫發(fā)病地20公里以內(nèi)地區(qū)的所有豬、牛等家畜。同時(shí)日本、美國(guó)、新加坡以及中國(guó)的臺(tái)灣和香港都已先后宣布禁止從韓國(guó)進(jìn)口豬肉和牛肉，有些國(guó)家和地區(qū)甚至把乳制品也列到禁止范圍之內(nèi)，給其本國(guó)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)于口蹄疫這種一類傳染性疾病，世界各國(guó)都不敢輕視，隨時(shí)都嚴(yán)陣以待，采取各項(xiàng)積極有效的措施，防止該病的發(fā)生，防范從國(guó)外傳入。

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ母咝聶z測(cè)技術(shù)，在許多領(lǐng)域已得到了廣泛應(yīng)用，因此可以利用其解決口蹄疫病毒多血清型和高變異性給臨床檢測(cè)造成的難題。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是于1996年被首次推出的，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR方法從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、檢測(cè)周期更短、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。

常規(guī)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse?Transcription?Polymerase?Chain?Reaction，RT-PCR)是先將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后利用DNA聚合酶在體外快速擴(kuò)增目的DNA片斷的技術(shù)。熒光實(shí)時(shí)RT-PCR是在普通RT-PCR的基礎(chǔ)上，在擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入一對(duì)引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸。在探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所吸收，從而檢測(cè)不到該探針熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號(hào)，而在PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’端外切酶活性將特異結(jié)合在目的擴(kuò)增片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中，脫離了熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽作用，此時(shí)可以檢測(cè)到熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)，熒光信號(hào)量的變化與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比。

由于口蹄疫病毒具有多個(gè)亞型且變異快，國(guó)內(nèi)外疫情的發(fā)生情況又較復(fù)雜，所以迫切需要建立一種特異敏感、準(zhǔn)確可靠、快速簡(jiǎn)便的口蹄疫病毒檢測(cè)方法，用于快速檢測(cè)國(guó)內(nèi)外主要流行的口蹄疫病毒亞型，從而滿足進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫和疫病監(jiān)控的需要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供用于檢測(cè)口蹄疫病毒通用型的PCR引物和熒光探針。