[發(fā)明專利]一種提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110201936.7
• 申請(qǐng)日: 2011-07-19
• 公開（公告）號(hào): CN102349443A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯喜林;于文佳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;高原

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法，專用于小菘菜游離小孢子培養(yǎng)。

技術(shù)背景

小菘菜(Brassica?campestris?var.peruviridis)系十字花科二年生草本植物，為不結(jié)球白菜的一個(gè)變種。原產(chǎn)亞洲，經(jīng)日本系統(tǒng)改良形成具有獨(dú)特風(fēng)味的品種。以幼嫩的植株供食用，品質(zhì)柔嫩，味道鮮美，經(jīng)烹調(diào)后色澤翠綠，營養(yǎng)價(jià)格高，超過綠葉菜之首的菠菜，并且具有防癌的保健功能。在日本市場(chǎng)周年供應(yīng)，成為銷售量最大的蔬菜品種之一。我國寧波市2002年開始大面積種植，目前已成為寧波市出口日本的主要?jiǎng)?chuàng)匯蔬菜品種之一。小菘菜為異花授粉植物，在育種上獲得一個(gè)純系需要5～6年的時(shí)間，而游離小孢子培養(yǎng)可以在1～2年獲得雙單倍體植株，大大節(jié)省純化時(shí)間和工作量。除此之外，小孢子還是一種優(yōu)良的轉(zhuǎn)化受體，它具備了單細(xì)胞和單倍體兩個(gè)特性，不會(huì)獲得雜合體或嵌合體，因此也是突變體篩選和基因工程研究的理想材料。

我國游離小孢子培養(yǎng)的起步較晚，但最近幾年，對(duì)不結(jié)球白菜的游離小孢子培養(yǎng)已取得了較大的進(jìn)展，李巖等(1993)、盧鋼等(2001)、蔣武生等(2005)和耿建峰等(2007)均獲得了不結(jié)球白菜小孢子再生植株，并對(duì)影響培養(yǎng)的各種因素進(jìn)行了分析，但小菘菜的游離小孢子培養(yǎng)未見過報(bào)道，馮輝(2007)曾利用花藥培養(yǎng)獲得了小菘菜的再生植株，但是花藥離體培養(yǎng)容易受到花藥壁、藥隔等二倍體細(xì)胞的干擾，后期檢測(cè)程序復(fù)雜，而小孢子已是單倍體細(xì)胞，具有花藥培養(yǎng)所不具備的單細(xì)胞單倍性、不受體細(xì)胞干擾、便于遺傳操作等優(yōu)點(diǎn)，但是游離小孢子培養(yǎng)受基因型的影響很大，而且小菘菜的游離小孢子培養(yǎng)出胚率很低，所以本發(fā)明旨在建立穩(wěn)定高頻的小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生體系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中小菘菜游離小孢子存在的培養(yǎng)效率低的問題，提供一種提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法。

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法，選取小菘菜單核靠邊期的花蕾，消毒后分離純化出小孢子，將純化后的小孢子懸浮于高糖培養(yǎng)基中，調(diào)整小孢子的密度達(dá)到1×10⁵～1×10⁶個(gè)/ml，置于33℃-35℃下黑暗處理12h-24h，離心棄上清后，加入低糖培養(yǎng)基，獲得小孢子懸浮液；其中，所述的高糖培養(yǎng)基是在1/2NLN培養(yǎng)基中加入15％-17％蔗糖及0.8mg/L-1.0mg/L秋水仙堿，再經(jīng)0.22μm的微孔濾膜抽濾滅菌所得，pH為6.0；所述的低糖培養(yǎng)基是在1/2NLN培養(yǎng)基加入10～13％蔗糖及0.5～0.8g/L活性炭，再經(jīng)0.22μm的微孔濾膜抽濾滅菌所得，pH為6.0。

所述的小孢子懸浮于高糖培養(yǎng)基后優(yōu)選于33℃黑暗處理24h。

所述的小菘菜單核靠邊期的花蕾長度為2.0mm-3.0mm，外觀特征為花瓣、花藥長度比為1/2～4/5。

消毒前將選取的適宜花蕾保濕并置于4℃冰箱中處理24h。

所述的消毒是將花蕾用75％的酒精消毒30s，然后用質(zhì)量比為0.1％的HgCl₂消毒6min，最后用無菌水沖洗3次待用。

所述的分離純化小孢子是將消毒后的花蕾置于研缽中，加入小孢子提取液，采用擠壓法使小孢子游離出來，然后用400目濾網(wǎng)過濾，將濾液收集于離心管，800rpm離心5min，棄上清液，重復(fù)3次；所述的小孢子提取液為小孢子提取液為加入10～13％蔗糖的B₅基本培養(yǎng)基，pH為5.8。

所述的離心條件是800rpm-1000rpm離心5min-7min。

所述的小孢子懸浮液于黑暗處理10d-14d后即可出現(xiàn)肉眼可見的胚狀體，將其置于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)出現(xiàn)子葉型胚后立即放于光照下轉(zhuǎn)綠，然后接到分化培養(yǎng)基上繼代進(jìn)而形成再生植株。

所述的分化培養(yǎng)基是在B₅基本培養(yǎng)基中加入10～13％蔗糖、0.1～0.3mg/L?6-BA、0.01～0.03mg/LNAA、0.6～0.9％瓊脂以及0.4～0.7g/L活性炭所得，pH為5.8。

本發(fā)明方法中培養(yǎng)基的滅菌條件均為：121℃，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘。

有益效果：

本發(fā)明提供了一種促進(jìn)小菘菜游離小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生的方法，培養(yǎng)的小孢子獲得了再生植株。