[發明專利]一種提高小菘菜游離小孢子胚胎發生率的方法

無效

• 申請號: 201110201936.7
• 申請日: 2011-07-19
• 公開（公告）號: CN102349443A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 侯喜林;于文佳
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;高原

1.一種提高小菘菜游離小孢子胚胎發生率的方法，其特征在于選取小菘菜單核靠邊期的花蕾，消毒后分離純化出小孢子，將純化后的小孢子懸浮于高糖培養基中，調整小孢子的密度達到1×10⁵～1×10⁶個/ml，置于33℃～35℃下黑暗處理12h～24h，離心棄上清后，加入低糖培養基，獲得小孢子懸浮液；其中，所述的高糖培養基是在1/2NLN培養基中加入15％～17％蔗糖及0.8mg/L～1.0mg/L秋水仙堿，再經0.22μm的微孔濾膜抽濾滅菌所得，pH為6.0；所述的低糖培養基是在1/2NLN培養基加入10～13％蔗糖及0.5～0.8g/L活性炭，再經0.22μm的微孔濾膜抽濾滅菌所得，pH為6.0。

2.根據權利要求1所述的提高小菘菜游離小孢子胚胎發生率的方法，其特征在于小孢子懸浮于高糖培養基后于33℃黑暗處理24h。

3.根據權利要求1所述的提高小菘菜游離小孢子胚胎發生率的方法，其特征在于所述的小菘菜單核靠邊期的花蕾長度為2.0mm～3.0mm。

4.根據權利要求1所述的提高小菘菜游離小孢子胚胎發生率的方法，其特征在于消毒前將選取的適宜花蕾保濕并置于4℃冰箱中處理24h。

5.根據權利要求1所述的提高小菘菜游離小孢子胚胎發生率的方法，其特征在于所述的消毒是將花蕾用75％的酒精消毒30s，然后用質量比為0.1％的HgCl₂消毒6min，最后用無菌水沖洗3次待用。

6.根據權利要求1所述的提高小菘菜游離小孢子胚胎發生率的方法，其特征在于所述的分離純化小孢子是將消毒后的花蕾置于研缽中，加入小孢子提取液，采用擠壓法使小孢子游離出來，然后用400目濾網過濾，將濾液收集于離心管，800rpm離心5min，棄上清液，重復3次；所述的小孢子提取液為加入10～13％蔗糖的B₅基本培養基，pH為5.8。

7.根據權利要求1所述的提高小菘菜游離小孢子胚胎發生率的方法，其特征在于所述的離心條件是800rpm～1000rpm離心5min～7min。

8.根據權利要求1所述的提高小菘菜游離小孢子胚胎發生率的方法，其特征在于所述的小孢子懸浮液于黑暗處理10d～14d后即可出現肉眼可見的胚狀體，將其置于振蕩培養箱中培養，當出現子葉型胚后立即放于光照下轉綠，然后接到分化培養基上繼代進而形成再生植株。

9.根據權利要求8所述的提高小菘菜游離小孢子胚胎發生率的方法，其特征在于所述的分化培養基是在B₅基本培養基中加入10～13％蔗糖、0.1～0.3mg/L?6～BA、0.01～0.03mg/LNAA、0.6～0.9％瓊脂以及0.4～0.7g/L活性炭，滅菌所得，pH為5.8。