[發明專利]磁性共價固定化酶載體的制備方法

有效

• 申請號: 201110201473.4
• 申請日: 2011-07-19
• 公開（公告）號: CN102286452A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 于洪巍;王丹;王玨;王博;劉敏
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08
• 代理公司: 杭州裕陽專利事務所(普通合伙) 33221
• 代理人: 應圣義

技術領域

本發明涉及生物化學領域，尤其涉及了一種磁性共價固定化酶載體的制備方法。

背景技術

固定化酶指經物理或化學方法處理后，使酶變成不易隨水流失即運動受限制，而又能發揮催化作用的酶制劑。與游離酶相比，固定化酶的優點有：可多次使用，且酶的穩定性提高；反應后，固定化酶易與底物和產物分離；反應條件易于控制，有利于自動化生產。

磁性納米結構的Fe₃O₄因其生物相容性，小尺寸效應，大的表面積，特殊磁性而受到廣泛的關注。國內外一些用Fe₃O₄作為載體來共價固定化酶的文獻，基本存在某些不足，如顆粒易團聚，酶裝載量不高，酶固定化反應時反應條件苛刻等。如文獻一：（Xia?Wang,?Wen?Wang,?Yi?Xu,?Daniel?I.?C.?Wang,?and?Zhi?Li/?Journal?of?the?american?chemical?society.?2009,?131,?12892-12893）反應體系是：首先甲基丙烯酸縮水甘油酯在油酸包裹的Fe₃O₄上發生聚合反應引人環氧基，然后加入乙二胺引入氨基，最后加入戊二醛使載體和酶交聯。雖然酶在載體上的活性沒有減少，但是每克載體裝載酶量也才達到16.1mg/g。文獻二：（?Xia?Wang,?Peipei?Dou,?Peng?Zhao,?Chuanming?Zhao,?Yi?Ding,?and?Ping?Xu/?ChemSusChem.?2009,?2,?947-950）反應體系是：氨水共沉淀鐵離子產生帶有氨基的Fe₃O₄顆粒，然后用戊二醛使載體和酶交聯。方法雖然巧妙得利用Fe₃O₄上殘有的氨基，但是酶的裝載量很有限，文獻中也沒給出確切的數值。文獻三：（Lin?Lei,?Xiao?Liu,?Yanfeng?Li,?Yanjun?Cui,?Yong?Yang,?Guorui?Qin/?Materials?Chemistry?and?Physics.?2011,?125,?866-871）反應體系是：在改性過的Fe₃O₄/?SiO_X納米顆粒上進行甲基丙烯酸縮水甘油酯的聚合反應，然后利用環氧基進行固定化酶。相比其它看過的文獻，用此方法得到了較好的裝載量—98.4?mg/g。但其固定化條件是在30℃載體和酶反應6小時，這多少會影響酶的活性。

本發明是利用載體上的疊氮基易與酶上的氨基發生置換從而達到固定作用。用此方法酶液不會接觸戊二醛等試劑，且是在較低的溫度（0℃）下與載體反應，因此對酶的活性及選擇性不會造成傷害，未參與固定的酶可回收繼續進行下一輪固定化。本發明的方法，首先制備出被油酸包裹且具有磁性納米結構的Fe₃O₄，接著Fe₃O₄與烯酸酯類反應得到酯基，然后和水合肼反應引入肼基，最后與亞硝酸反應生成疊氮基。利用本發明方法得到的顆粒載體在反復用十幾次后其酶活保留還是100?%。

水溶性聚乙二醇（PEG）因其無免疫性、無毒性、無蛋白依附性而被用于酶等生物活性物質固定化載體。本發明中PEG在反應體系中起到很好的混溶和分散的作用。

發明內容

本發明的目的是提供一種工藝簡單，操作成本低，酶裝載量高，穩定性好，在有機相和水相中具有很強的分散性的磁性共價固定化酶載體的制備方法。

為了解決上述技術問題，本發明通過下述技術方案得以解決：

磁性共價固定化酶載體的制備方法，包括以下步驟：

步驟a：制備油酸包裹的Fe₃O₄納米顆粒：

先通過氮氣排出三口瓶中的空氣，將FeCl₃?6H₂O、FeSO₄?7H₂O以摩爾比為2~5：0.2~2的比例混合并加到三口瓶中，加入包裹劑，將其放置于50-80℃恒溫攪拌池中攪拌0.5-2.5小時；加入堿性溶液，調節反應液pH值于9-13之間，繼續攪拌30分鐘；攪拌結束后，利用磁場分離出磁性顆粒；洗滌磁性顆粒，至洗滌液的pH?=?7，即可得到黑色的油酸包裹的Fe₃O₄納米粒子，用冷凍干燥機凍干或用烘箱烘干以備用；