[發明專利]一種黃牛TMEM18基因的單核苷酸多態性檢測方法

有效

• 申請號: 201110201229.8
• 申請日: 2011-07-18
• 公開（公告）號: CN102251038A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 陳宏;馬偉;劉棟;孫曉梅;馬云;藍賢勇;李愛民;胡沈榮
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子遺傳學領域，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)的檢測，特別涉及一種檢測黃牛TMEM18基因第3843位和第3873位單核苷酸多態性的檢測方法。

背景技術

單核苷酸多態性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態性。因此，通常所說的SNPs包括堿基的替換、插入、缺失以及重復序列拷貝數的變化。一個SNP表示在基因組某個位點上有一個核苷酸的變化，主要由單個堿基的轉換或者顛換所引起；具有轉換型變異的SNPs約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發生突變的位點，其中大多數是甲基化的，可自發地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。

在任何已知或未知的基因內或附近都可能找到數量不等的SNPs，根據它們在基因組中分布的位置可分為基因編碼區SNPs(cSNPs)、基因周邊SNPs(pSNPs)和基因間SNPs(iSNPs)等三類。總的說來，cSNP比較少，因為在外顯子內的變異率僅占周圍序列的1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關注。根據對遺傳性狀的影響，cSNPs又可分為兩種：一種是同義cSNPs，即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質中氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的“含義”相同；另一種是非同義cSNPs，即堿基序列的改變將導致編碼氨基酸的改變，從而產生蛋白質序列的改變，可能最終影響到蛋白質的功能。因此，對編碼區SNPs的非同義突變來說，它們可能對基因功能有直接的重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。

由于SNPs是二等位基因分子標記，所以，理論上在一個二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個、3個或4個等位基因構成，但實際上3個或4個等位基因的SNPs很罕見，故SNPs通常被簡單地稱為二等位基因分子標記。目前，主要采用幾種不同的路線來發現SNPs：即DNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA測序結合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應等。在這些SNP檢測技術中，DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測方法，但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術人員和經驗，所以，DNA序列測定法不是一種應用于生產實際的理想SNP檢測方法；當然，利用PCR-SSCP與DNA測序結合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應用領域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應用的特點；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應技術檢測SNP位點，需要平板讀數儀、基因芯片、微球陣列技術和質譜儀等檢測平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強。

PCR-RFLP方法是一種檢測SNP的有效技術，在發現SNP位點后使用限制性內切酶進行切割，然后進行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準確地鑒別SNP位點。PCR-RFLP方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要求。

跨膜蛋白18(TMEM18)基因是通過GWA方法鑒定的與人類肥胖相關的重要基因，同FTO基因和MC4R基因一樣，TMEM18基因起源很早(Cristen?J?Willer，Elizabeth?K?Speliotes，Ruth?J?F?Loos，et?al.Six?new?loci?associated?with?body?mass?index?hightlight?a?neuronal?influence?on?body?weight?regulation.Nature?genetics?2008；41：25-34.)。

TMEM18基因主要是在神經細胞中大量表達，其它組織：肝臟，肺，腦垂體以及卵巢附睪中也有表達。黃牛TMEM18基因定位于1號染色體上，由5個外顯子和4個內含子組成，它的CDS區長419bp，共編碼140個氨基酸。