[發(fā)明專利]一種檢測黃牛FGF21基因單核苷酸多態(tài)性的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110201228.3
• 申請日: 2011-07-18
• 公開（公告）號: CN102296110A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳宏;孫曉梅;李明勛;馬偉;藍賢勇;王璟;滑留帥
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測成纖維細胞生長因子21(fibroblast?growth?factor?21，F(xiàn)GF21)基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)方法，具體地說，是一種利用限制性內(nèi)切酶對包含該單核苷酸多態(tài)性位點的基因序列進行酶切，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳對其進行片段大小分離，利用凝膠成像系統(tǒng)分析其片段大小，從而確定其SNP。

背景技術(shù)

單核苷酸多態(tài)性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。

近年來，人們發(fā)展了許多用于探尋分子遺傳標(biāo)記的方法，最常見的有單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)(SSCP)、直接測序技術(shù)和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁瑣、耗時長，結(jié)果易造成誤判；而直接測序技術(shù)成本又較高。PCR-RFLP方法是一種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點后使用限制性內(nèi)切酶進行切割，然后進行瓊脂糖凝膠電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別SNP位點。PCR-RFLP方法不僅具有DNA測序法的準(zhǔn)確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要求。

成纖維細胞生長因子21(fibroblast?growth?factor?21，F(xiàn)GF21)是一種主要的脂肪代謝調(diào)節(jié)因子，具有調(diào)控能量代謝的作用，在動物模型中作為一個代謝調(diào)控子的發(fā)現(xiàn)引起了研究者的關(guān)注。FGF21在肝臟中特異的表達，可通過作用于脂肪組織及胰腺來降低血糖和甘油三酯含量，從而預(yù)防飲食誘導(dǎo)的肥胖及胰島素抵抗。對于黃牛育種來講，分析FGF21基因在牛脂肪代謝及能量平衡中的機制，對于提高黃牛的育肥效率、提高肉品質(zhì)具有重要的理論意義。

國內(nèi)外未見關(guān)于FGF21基因遺傳變異的研究，該基因位點的功能研究及其遺傳變異與經(jīng)濟性狀(如：體重等)關(guān)聯(lián)的研究仍是空白。由于FGF21基因功能涉及體重等生長性狀，本發(fā)明提供的檢測方法為FGF21基因的SNP與中國黃牛生長性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國黃牛生長性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的問題在于利用PCR-RFLP方法檢測黃牛FGF21基因的多態(tài)性，并將其與生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，驗證其是否可以作為黃牛分子育種中輔助選擇的分子標(biāo)記，從而加快良種選育速度。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一種快速檢測黃牛FGF21基因SNP的RFLP方法，以包含F(xiàn)GF21基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P1、P2、P3為引物，PCR擴增黃牛FGF21基因(全長1459bp，含3個外顯子和2個內(nèi)含子)，發(fā)現(xiàn)4個SNP位點；針對這4個SNP位點分別設(shè)計引物對F159、F297、F940、F1151，依次人為引入SalI、XhoI、XbaI、MspI酶切位點，進行PCR擴增，用限制性內(nèi)切酶SalI、XhoI、XbaI、MspI分別酶切該四對引物的PCR擴增產(chǎn)物，再用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切后的片段，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛FGF21基因第159位、第297位、第940位、第1151位的單核苷酸多態(tài)性。

所述的引物對P1為：

上游引物：5′ATGGGCTGGGACGAGGCCAAGTTC??3′，

下游引物：5′CAAACCAAGCCTGACCAACATCAAA??3′；

所述的引物對P2為：

上游引物：5′GGAAGCTGTACGGATCGGTGAG??3′，

下游引物：5′CTCCTTTCTCAGCTTTATCGTCTAGG??3′；

所述的引物對P3為：

上游引物：5′CCTGCCTCCGTGGTTTTGAG??3′，

下游引物：5′TCAAGAAGTGTAGCTGGGGCTTCG??3′。

將該三對引物的PCR產(chǎn)物送測序，根據(jù)測序結(jié)果及突變情況，在黃牛FGF21基因第159位、第297位、第940位和第1151位處重新設(shè)計引物，并依次人為引入SalI、XhoI、XbaI、MspI酶切位點，以引物對F159、F297、F940、F1151為引物，PCR擴增黃牛FGF21基因：

所述的引物對F159為：

上游F159-SalI：5′CCGCCAGCGGTACCTCTACACGGTCGA??3′，

下游R159：5′TCCAAGAGACCTGAGGGGAGAAAGTGGG??3′；

所述的引物對F297為：