[發(fā)明專利]改良高特異性PCR方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110200385.2
• 申請日: 2011-07-12
• 公開（公告）號: CN102876659A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設計）人: 李彬
• 申請（專利權）人: 李彬
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

適用于各種和基因表達相關的實驗和研究領域。

技術背景

聚合酶鏈式反應簡稱(Polymerase?Chain?Reaction)，簡稱PCR。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA、RNA的地方，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。雖然如此，許多PCR實驗中仍然經(jīng)常出現(xiàn)假陽性和非特異擴增，為許多實驗帶來了巨大的困擾。因此，一種高特異性性的PCR方法對于科學實驗和研究顯得尤為重要。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種高特異性的PCR方法。

本發(fā)明的整體技術構思是：熱啟動PCR和降落PCR可以在一定程度上提高PCR的特異性，本文將這兩種方法結合起來，并在一定程度上進行了改進，最大程度上減少非特異性產(chǎn)物和背景，從而得到一種高特異性的PCR方法。

高特異性的改良PCR方法如下：

(1)將蠟丸同時加入dNTP，MgCl₂，引物以及部分10×緩沖液，加熱80蠟丸融化，室溫冷卻，在表面形成一種蠟隔層。

(2)在蠟隔層上加入DNA?Taq酶，DNA模板，以及部分10×緩沖液，進入PCR循環(huán)。

(3)PCR程序設計：將復性溫度初始值設置為70℃，每次下降1℃直至最適退火溫度，每個溫度循環(huán)2-4次。

(4)第三步完成以后，再在變性，復性，延伸，最適程序下進行30個循環(huán)左右。

(5)最后，72℃后延伸5-10min。

(6)最后在4℃下保存。

本發(fā)明不僅能夠避免由于引物和非靶位點的錯配和引物形成二聚體引起的擴增，還可以避免由于Mg²⁺不適當，Tm(變形溫度)值和Ta(退火溫度)值相距較遠的一對引物，復雜的模板DNA等原因引起的假陽性的出現(xiàn)。與傳統(tǒng)的PCR相比，能夠顯著增加特異產(chǎn)物的量，同時降低或消除了非特異性產(chǎn)物。

以下結合實例對本發(fā)明進一步描述

高特異性的改良PCR方法如下：

(7)將蠟丸同時加入dNTP，MgCl₂，引物以及部分10×緩沖液，加熱80蠟丸融化，室溫冷卻，在表面形成一種蠟隔層

(8)在蠟隔層上加入DNA?Taq酶，DNA模板，以及部分10×緩沖液，進入PCR循環(huán)。

(9)PCR程序設計：將復性溫度初始值設置為70℃，每次下降1℃直至最適退火溫度，每個溫度循環(huán)2-4次。

(10)第三步完成以后，再在變性，復性，延伸，最適程序下進行30個循環(huán)左右。

(11)最后，72℃后延伸5-10min。

最后在4℃下保存。