[發(fā)明專利]一種白土苓基原植物DNA分子鑒別方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110200358.5
• 申請日: 2011-07-18
• 公開（公告）號: CN102337330A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張思巨;李進(jìn)冉;仰振球;袁慶軍;范圣此;海麗娜;胡紅宇
• 申請（專利權(quán)）人: 北京振東光明藥物研究院有限公司;山西振東道地藥材開發(fā)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京太兆天元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11108
• 代理人: 張韜

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及白土苓DNA分子鑒別方法。

背景技術(shù)

白土苓為百合科肖菝葜屬植物短柱肖菝葜Heterosmilax?yunnanensis?Gagnep.、華肖菝葜H.chinensis?Wang或肖菝葜H.japonica.Kunth的干燥塊莖。其混用比較嚴(yán)重，尤其是與菝葜屬植物存在混用，二者植物形態(tài)差別不大，鑒別不易。

肖菝葜，無刺灌木，攀緣，少有直立。葉紙質(zhì)，少有近革質(zhì)，有3-5條主脈和網(wǎng)狀支脈；葉柄具或不具卷須，在上部有一脫落點(diǎn)，因而在葉片脫落時(shí)總是帶著一段短的葉柄(纖柄肖菝葜幾乎不帶葉柄)。傘形花序生于葉腋或鱗片腋內(nèi)；總花梗常多少扁平，在總花梗著生點(diǎn)和葉柄之間多半有一腋生芽；花小，雌雄異株；花被片合生成筒狀，稱花被筒，筒口一般有3(2-6)小齒；雄花有3-12枚雄蕊，花絲或多或少合生成一柱狀體，少有完全分離；花藥基著，2室，內(nèi)向，近藥隔邊緣開裂，無退化子房；雌花有3-6退化雄蕊，生于子房基部或筒上，絲狀或條形；子房3室，每室有2胚珠，柱頭3裂。漿果球形，有1-3顆種子。

肖菝葜含有多種化學(xué)成分，主要含有皂苷類、蒽醌類、甾醇類、黃酮類、有機(jī)酸類、酚苷類、烷烴類、多糖類、鞣質(zhì)類等成分。它具有清熱、除濕、解毒、通利關(guān)節(jié)的功效，臨床用于濕熱淋濁，帶下，疥癬，楊梅毒皰，筋骨攣痛，瘰疬癰腫及鉤端螺旋體等病。

本屬區(qū)別于菝葜屬的唯一性狀是花被片合生成筒狀，而本屬植物的種間主要鑒別點(diǎn)也是在花。白土苓的花期較短，并受生長環(huán)境影響，生長分散，較難采集具有代表性數(shù)量的帶花植物，為白土苓藥材的基原鑒別增加了難度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于公開一種白土苓DNA分子鑒別方法，特別是白土苓中短柱肖菝葜、華菝葜和肖菝葜中DNA分子鑒別方法。

本發(fā)明目的是通過如下方案實(shí)現(xiàn)的：

一種短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜的DNA分子鑒別方法，其特征在于通過如下步驟實(shí)現(xiàn)：

(1)總DNA的提取

取待測短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜植物葉片，提取獲得總DNA。

(2)PCR擴(kuò)增

選取葉綠體DNA基因間序列引物

引物1：Forward-Primer：5’-TTGAGCTCCATCTACAAATGG-3’

引物2：Reverse-Primer：5’-CCCTTATCTAGCTAAAGGATT-3’

進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

(3)總DNA的序列測定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

(4)DNA序列分析及植物鑒別

測序結(jié)果先用Contig?Express(Informax?2000)序列比對軟件校序，再用BioEdit序列編輯軟件對序列進(jìn)行編輯，尋找種間變異位點(diǎn)，結(jié)果為：其中190bp的C/A替代和366-402bp37個(gè)堿基插入/缺失是短柱肖菝葜的鑒別特征位點(diǎn)；262-302bp40個(gè)堿基和342-350bp9個(gè)堿基的插入/缺失是華肖菝葜和肖菝葜的鑒別特征位點(diǎn)。其中(1)所述的總DNA的提取的具體步驟為：

1)用研磨儀將用硅膠干燥的葉片在2ml離心管中研磨至粉末狀。

2)加入900μl預(yù)熱的2×CTAB提取液(十六烷基三甲基溴化銨4g；NaCl?16.364g；1MPH8.0的Tris-HCl?20ml；0.5M?EDTA?8ml)和6μlβ-巰基乙醇，60℃-70℃水浴溫浴1.5-2小時(shí)。

3)將溫浴的材料冷卻至室溫，加入等體積的24∶1的氯仿-異戊醇混合溶液，搖勻5-10分鐘，然后離心5-10分鐘，取上清液。

4)將上清液轉(zhuǎn)移到一新的2ml離心管中，再加入等體積的24∶1的氯仿-異戊醇混合溶液，搖勻5-10分鐘，然后離心5-10分鐘，取上清液。

5)將上清液轉(zhuǎn)移到一新的1.5ml離心管中，加入相當(dāng)上清液體積70％的異丙醇，沉降DNA，顛倒離心管2-3次，可見白色絮狀沉淀，-20℃冰箱中靜置30分鐘，離心5-10分鐘，棄上清液，得固體沉淀。

6)固體沉淀用500μl?75％乙醇和無水乙醇各洗1次，離心20-30s后棄上清，然后將離心管吹干使乙醇完全揮發(fā)，得到短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜植物的總DNA。