[發明專利]一種白土苓基原植物DNA分子鑒別方法

有效

• 申請號: 201110200358.5
• 申請日: 2011-07-18
• 公開（公告）號: CN102337330A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 張思巨;李進冉;仰振球;袁慶軍;范圣此;海麗娜;胡紅宇
• 申請（專利權）人: 北京振東光明藥物研究院有限公司;山西振東道地藥材開發有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京太兆天元知識產權代理有限責任公司 11108
• 代理人: 張韜

1.一種短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜的DNA分子鑒別方法，其特征在于通過如下步驟實現：

(1)總DNA的提?。喝〈郎y短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜植物葉片，提取獲得總DNA；

(2)PCR擴增：選取葉綠體DNA基因間序列引物

引物1：Forward-Primer：5’-TTGAGCTCCATCTACAAATGG-3’

引物2：Reverse-Primer：5’-CCCTTATCTAGCTAAAGGATT-3’

進行PCR擴增，擴增結果用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測；

(3)總DNA的序列測定：PCR擴增產物直接測序；

(4)DNA序列分析及植物鑒別：測序結果先用Contig?Express序列比對軟件校序，再用BioEdit序列編輯軟件對序列進行編輯，尋找種間變異位點，結果為：其中190bp的C/A替代和366-402bp37個堿基插入/缺失是短柱肖菝葜的鑒別特征位點；262-302bp40個堿基和342-350bp9個堿基的插入/缺失是華肖菝葜和肖菝葜的鑒別特征位點。

2.如權利要求1所述的DNA分子鑒別方法，其特征在于其中(1)所述的總DNA的提取的具體步驟為：

(1)用研磨儀將用硅膠干燥的葉片在2ml離心管中研磨至粉末狀；

(2)加入900μl預熱的2×CTAB提取液和6μlβ-巰基乙醇，60℃-70℃水浴溫浴1.5-2小時；

(3)將溫浴的材料冷卻至室溫，加入等體積的24∶1的氯仿-異戊醇混合溶液，搖勻5-10分鐘，然后離心5-10分鐘，取上清液；

(4)將上清液轉移到一新的2ml離心管中，再加入等體積的24∶1的氯仿-異戊醇混合溶液，搖勻5-10分鐘，然后離心5-10分鐘，取上清液；

(5)將上清液轉移到一新的1.5ml離心管中，加入相當上清液體積70％的異丙醇，沉降DNA，顛倒離心管2-3次，可見白色絮狀沉淀，-20℃冰箱中靜置30分鐘，離心5-10分鐘，棄上清液，得固體沉淀；

(6)固體沉淀用500μl?75％乙醇和無水乙醇各洗1次，離心20-30s后棄上清，然后將離心管吹干使乙醇完全揮發，得到短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜植物的總DNA；將上述的總DNA干燥后加入0.1×TE緩沖液100μl和1-2μl的RNase于室溫下消化RNA11-13小時，混勻后用0.5-1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；

其中(2)PCR擴增條件為：

PCR擴增反應采用20μl體系，其組分及終濃度：

反應程序：在92℃-96℃下反應2-6分鐘后，在92℃-96℃反應30秒-45秒，55℃-60℃?25秒-35秒，70℃-74℃1.分鐘-2分鐘，28-32個循環后，再在70℃-74℃下反應5分鐘-10分鐘。擴增結果用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，均出現清楚的擴增條帶。

3.如權利要求1或2所述的DNA分子鑒別方法，其特征在于其中(2)PCR擴增條件為：

PCR擴增反應采用20μl體系，其組分及終濃度：

反應程序：94℃4分鐘后，94℃45秒，58℃30秒，72℃1分30秒，30個循環后，再反應72℃7分鐘；擴增結果用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

4.如權利要求1或2所述的DNA分子鑒別方法，其特征在于其中(1)所述的總DNA的提取的具體步驟為：

取待測短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜植物葉片，

(1)用研磨儀將用硅膠干燥的葉片在2ml的離心管中研磨至粉末狀；

(2)加入900μl預熱的2×CTAB提取液，65℃水浴溫浴1.5小時；

(3)將溫浴的材料冷卻至室溫，加入等體積的24∶1的氯仿-異戊醇混合溶液，搖勻5分鐘，然后離心5分鐘，取上清液；

(4)將上清液轉移到一新1.5ml離心管中，再加入等體積的24∶1氯仿-異戊醇，搖勻5分鐘，然后離心5分鐘，取上清液；

(5)將上清液轉移到一新的1.5ml離心管中，加入相當上清液體積70％的異丙醇，沉降DNA，顛倒離心管2-3次，白色絮狀沉淀，-20℃冰箱中靜置30分鐘，離心5分鐘，棄上清液，得固體沉淀；

(6)固體沉淀用200μl?70％的乙醇和200μl無水乙醇各洗1次，離心30s后棄上清，然后將離心管吹干使乙醇完全揮發，得到短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜植物的總DNA；

(7)將上述的總DNA干燥后加入0.1×TE緩沖液和1-2μl?RNase核糖核酸酶于室溫下消化RNA過夜，混勻后用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測。