[發明專利]一種用于煙草花粉的高效誘變方法

無效

• 申請號: 201110200354.7
• 申請日: 2011-07-18
• 公開（公告）號: CN102293154A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發明（設計）人: 蔡長春;林國平;曹景林;王毅;楊樹;張俊杰
• 申請（專利權）人: 湖北省煙草科研所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 武漢楚天專利事務所 42113
• 代理人: 雷速

技術領域

本發明涉及煙草誘變技術領域，特別是涉及一種用于煙草花粉的高效誘變方法。

背景技術

煙草(Nicotiana?tabacum?L，.)在植物分類學上屬于雙子葉植物綱(Dicotyledoneae)、管花目(Tubifiorae)、茄科(Solanaceae)煙草屬(Nicotiana)，是許多國家的重要經濟作物，其中烤煙(2n＝24II)是中國也是世界上種植面積最大的煙草類型。

長期以來，由于煙草育種中過度使用為數不多的幾個主體親本，加之定向選擇，使得育成品種遺傳基礎狹窄、品種單一化現象日趨嚴重，導致很難培育出有較大突破性的新品種，經常出現新品種“審而不種”的尷尬局面，也給以遺傳多樣性為基礎的分子標記遺傳連鎖圖譜構建和基因定位帶來了較大困難。

已有的研究表明，盡管不同煙草種間遺傳多樣性較種內稍顯豐富，但相比其他農作物如水稻、油菜、玉米等其種質資源間的遺傳多樣性仍相差甚遠。因為對種間雜交后代性狀的改良其難度更大，所需時間更多，因此在實際的育種工作中較少會利用種間雜交方式培育新品種，而更多的是利用同一煙草類型即種內親本來選育品種以縮短對目標后代綜合性狀的改良時間。因此，國內許多煙草科技工作者試圖通過物理和化學等人為誘變的方法以有效拓寬煙草狹窄的遺傳背景，豐富其種質資源的遺傳多樣性，這些誘變方法一般是利用X-射線、γ-射線、⁶⁰Coγ、中子、高速離子、宇宙射線等物理因素，或者甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)、疊氮化鈉、堿基類似物、PEG等化學因素對煙草種子、幼苗、莖尖、幼胚、合子等組織進行誘變處理，也取得了一些較好的成果。但這些誘變處理不同程度的存在誘變劑難吸收、誘變頻率低、變異幅度小、后代篩選難度大、產量低及易產生嵌合體等問題。

發明內容

本發明根據現有技術的不足提供一種用于煙草花粉的高效誘變方法，該方法在煙草花粉離體液體培養的游離狀態下施以EMS化學誘變，可大大增強煙草遺傳物質對外界誘變因素的敏感性，從而成倍提高誘變頻率和變異幅度，產生變異的花粉再經過加倍處理后以純合二倍體的形式將突變性狀予以很好的保持和固定，克服了基因表達上顯隱性的障礙，有利于選擇，且大大縮短了突變體性狀穩定的周期，節省了育種時間

為實現上述目的，本發明所述的一種用于煙草花粉的高效誘變方法，其具體步驟依次如下：

(1)樣品采集：取煙株主花序或側花序上健康的、花粉處于單核靠邊期的適齡花蕾，迅速保存于冰盒；

(2)消毒處理：在超凈工作臺上剝取花蕾中的花藥，將取出的花藥用無菌紗布或無菌市售絲襪裝好浸入70-75％濃度的乙醇中消毒10-15s，再浸入飽和次氯酸鈣溶液中浸泡8-10min，最后用無菌水漂洗多次；

(3)收集花粉：將步驟2中消毒處理后的花藥放入圓底試管中，加入1-3ml的B5-13液體培養基，再加入1-2ml用于軟化花藥壁的酶液，碾成勻漿，然后用裝有300-400目雙層尼龍膜的漏斗進行過濾，并用離心管收集濾液，離心處理后去上清液，加B5-13液體培養基重新懸浮，再次離心處理后去上清液；

(4)誘變處理：將步驟3中經過兩次離心處理后收集的花粉用B5-13液體培養基懸浮，加入濃度為0.1-0.2％的EMS(甲基磺酸乙酯)溶液進行誘變處理，放入溫度為30-32℃的環境下避光培養8-10h；

(5)加倍處理：將步驟4中誘變處理后的花粉溶液移入離心管中離心處理后去上清液8-10min，再用NLN-16液體培養基懸浮后轉入玻璃容器中，放置在溫度為30-32℃的環境避光培養50-70h，進行加倍處理；

(6)誘胚培養：將步驟5中的加倍處理后的花粉溶液移入離心管中離心處理后去上清液，用NLN-13液體培養基懸浮花粉，轉入培養皿中，放置在溫度為24-26℃的環境下，進行避光誘胚培養14-21d，待培養皿中出現幼胚，便將培養皿放置轉速為56-65r/min的搖床內，在溫度為24-26℃環境下避光振蕩培養6-8d；

(7)繼代培養：將步驟6中培養皿內出現子葉的胚轉移到MS固體培養基上，在溫度為25-27℃、日光照為8-10h的環境中進行繼代培養；

(8)幼苗轉植：對步驟7中繼代培養的幼苗進行煉苗，將通過煉苗后的幼苗根部的培養基清洗干凈，移栽到溫室的花缽中假植或者直接栽種于大田中進行突變體鑒定。

步驟1中所述的適齡花蕾為長度在2.0-2.3cm之間、花冠與花萼等長、花粉發育時期為單核靠邊期的花蕾。