[發明專利]一種用于煙草花粉的高效誘變方法

無效

• 申請號: 201110200354.7
• 申請日: 2011-07-18
• 公開（公告）號: CN102293154A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發明（設計）人: 蔡長春;林國平;曹景林;王毅;楊樹;張俊杰
• 申請（專利權）人: 湖北省煙草科研所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 武漢楚天專利事務所 42113
• 代理人: 雷速

1.一種用于煙草花粉的高效誘變方法，其特征在于：所述方法依次按以下操作步驟進行：

(1)樣品采集：取煙株主花序或側花序上健康的、花粉處于單核靠邊期的適齡花蕾，迅速保存于冰盒；

(2)消毒處理：在超凈工作臺上剝取花蕾中的花藥，將取出的花藥用無菌紗布或無菌市售絲襪裝好浸入70-75％濃度的乙醇中消毒10-15s，再浸入飽和次氯酸鈣溶液中浸泡8-10min，最后用無菌水漂洗多次；

(3)收集花粉：將步驟2中消毒處理后的花藥放入圓底試管中，加入1-3ml的B5-13液體培養基，再加入1-2ml用于軟化花藥壁的酶液，碾成勻漿，然后用裝有300-400目雙層尼龍膜的漏斗進行過濾，并用離心管收集濾液，離心處理后去上清液，加B5-13液體培養基重新懸浮，再次離心處理后去上清液；

(4)誘變處理：將步驟3中經過兩次離心處理后收集的花粉用B5-13液體培養基懸浮，加入濃度為0.1-0.2％的EMS溶液進行誘變處理，放入溫度為30-32℃的環境下避光培養8-10h；

(5)加倍處理：將步驟4中誘變處理后的花粉溶液移入離心管中離心處理后去上清液8-10min，再用NLN-16液體培養基懸浮后轉入玻璃容器中，放置在溫度為30-32℃的環境避光培養50-70h，進行加倍處理；

(6)誘胚培養：將步驟5中的加倍處理后的花粉溶液移入離心管中離心處理后去上清液，用NLN-13液體培養基懸浮花粉，轉入培養皿中，放置在溫度為24-26℃的環境下，進行避光誘胚培養14-21d，待培養皿中出現幼胚，便將培養皿放置轉速為56-65r/min的搖床內，在溫度為24-26℃環境下避光振蕩培養6-8d；

(7)繼代培養：將步驟6中培養皿內出現子葉的胚轉移到MS固體培養基上，在溫度為25-27℃、日光照為8-10h的環境中進行繼代培養；

(8)幼苗轉植：對步驟7中繼代培養的幼苗進行煉苗，將通過煉苗后的幼苗根部的培養基清洗干凈，移栽到溫室的花缽中假植或者直接栽種于大田中進行突變體鑒定。

2.根據權利要求1所述的一種用于煙草花粉的高效誘變方法，其特征在于：步驟1中所述的適齡花蕾為長度在2.0-2.3cm之間、花冠與花萼等長、花粉發育時期為單核靠邊期的花蕾。

3.根據權利要求1所述的一種用于煙草花粉的高效誘變方法，其特征在于：步驟2中的飽和次氯酸鈣的濃度為10％；無菌水漂洗2-3次，每次4-6min。

4.根據權利要求1所述的一種用于煙草花粉的高效誘變方法，其特征在于：步驟3中所述酶液為纖維素酶、果膠酶、蝸牛酶和水的混合液，酶液中纖維素酶、果膠酶和蝸牛酶的質量濃度分別為0.6％、0.2％和0.5％。

5.根據權利要求1所述的一種用于煙草花粉的高效誘變方法，其特征在于：步驟3中第一次離心時間5min，轉速1000r/min，二次離心時間5min，轉速500r/min；步驟5和6中的離心處理時間都為5min，轉速800r/min。

6.根據權利要求1所述的一種用于煙草花粉的高效誘變方法，其特征在于：步驟5中NLN-16液體培養基中秋水仙素的濃度為45-65mg/L。

7.根據權利要求1所述的一種用于煙草花粉的高效誘變方法，其特征在于：步驟5中加倍處理的玻璃容器為100ml三角瓶，每瓶裝10ml溶液，密度為3-4蕾/ml。